基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的非酒精性脂肪性肝病脂質(zhì)貯積機制研究.pdf

1、近年來，隨著生活生平的提高和生活習慣的改變，非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病率逐年升高，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及其相關肝硬化、肝細胞肝癌等。NAFLD的發(fā)生發(fā)展與肥胖、2型糖尿病、高血壓等代謝性疾病關系密切，是遺傳-環(huán)境-代謝應激相關性疾病，但其確切的發(fā)病機制并未明確。經(jīng)典的“二次打擊”學說并不能完全解釋NAFLD

2、的全部機制。NAFLD的發(fā)生是肝細胞不斷貯積脂質(zhì)的過程，從肝細胞脂質(zhì)貯積的分子機制入手，將為NAFLD的發(fā)病機制研究提供新線索。
　　肝細胞脂質(zhì)貯積主要與脂質(zhì)攝取、合成、分泌以及氧化清除相關。微囊蛋白1(Caveolin-1)是微囊的主要結構蛋白，也是一個多功能的信號蛋白。結合文獻閱讀和前期研究，我們推測caveolin-1的表達缺失可能通過增加脂肪酸攝取與合成，促進脂質(zhì)貯積、介導炎癥反應，加速NAFLD的發(fā)生發(fā)展。我們利用NAF

3、LD小鼠和細胞模型，應用最新的基因編輯技術--CRISRP/Cas9系統(tǒng)以及重組慢病毒技術，干預caveolin-1表達。研究發(fā)現(xiàn):caveolin-1的表達與肝臟脂肪變性程度相關，caveolin-1的表達缺失，導致肝細胞脂肪變性加重、脂質(zhì)貯積增加，脂質(zhì)合成相關蛋白(SREBP-1、FASN、ACC)表達上調(diào)，炎癥因子COX-2表達增加，因此，caveolin-1可能是NAFLD發(fā)生的保護因子。
　　蛋白質(zhì)的泛素化修飾與降解，是

4、維護脂質(zhì)貯積過程中相關蛋白正常功能和清除錯誤蛋白的重要途徑。泛素連接酶通過決定泛素化的時間性和特異性，間接調(diào)控蛋白酶體介導的蛋白底物降解，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，影響脂質(zhì)貯積。由于E3連接酶既定了泛素化通路底物的特異性，因此篩選脂質(zhì)貯積相關E3連接酶，有助于發(fā)現(xiàn)NAFLD中脂質(zhì)代謝異常通路，開發(fā)潛在藥物，具有重大的生物學意義和臨床效應。我們利用實驗平臺和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構建了包含人類2196個E3連接酶sgRNA的慢病毒庫和首個人E3

5、連接酶敲除細胞庫，運用BODIPY(@)493/503染料和NAFLD細胞模型建立了脂質(zhì)熒光報告系統(tǒng)，通過流式技術進行功能E3連接酶的篩選，發(fā)現(xiàn)了24個影響NAFLD中脂質(zhì)貯積的E3連接酶。WWP2等10個E3連接酶具有促脂質(zhì)貯積作用，ING2、UBE2D1等14個E3連接酶是脂質(zhì)貯積的負調(diào)控因子。這些E3連接酶的發(fā)現(xiàn)，有助于深入研究泛素-蛋白酶體通路對NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用，開發(fā)特效藥物。
　　上述研究結果闡述了caveoli