非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)胰島素抵抗機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFID)是一種代謝相關(guān)性疾病，隨著國(guó)人生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)NAFLD發(fā)病率持續(xù)明顯上升，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化，其中NASH是該病發(fā)展的的中心環(huán)節(jié)，是發(fā)展為肝纖維化

2、和硬化的必經(jīng)階段．目前有關(guān)NAFLD的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，學(xué)者們普遍認(rèn)為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)作為肝臟的“二次打擊”是NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，迄今有關(guān)NAFLD發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中IR的發(fā)生和維持的分子機(jī)制尚未闡明。本研究擬建立NAFLD大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究NAFLD胰島素抵抗(IR)的主要相關(guān)靶器官或組織、血生化變化特點(diǎn)；探討NAFLD發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中IR的作用和分子機(jī)制，為NAFLD的防治提供依據(jù)。

3、 方法: 建立高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型，組織病理學(xué)結(jié)合血生化檢測(cè)對(duì)所建立的模型進(jìn)行評(píng)價(jià)；利用穩(wěn)態(tài)HOMA_IR、HOMA_β、DI模型對(duì)NAFLD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行IR的動(dòng)態(tài)觀測(cè)。為研究NAFLD IR的主要靶部分及分子機(jī)制，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)胰腺、肝臟及腹部組織胰島素信號(hào)蛋白的表達(dá)情況，并觀測(cè)代謝調(diào)節(jié)蛋白SREBP-1c、PPARγ、GLUT-4、SOCS-3的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)胰腺組織的PCNA及Fas-L的表達(dá)，

4、以觀測(cè)胰島的增生及凋亡水平，應(yīng)用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)肝臟組織ISR及GLUT4的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果: 1．組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，所建立的實(shí)驗(yàn)大鼠NAFLD模型6-8w呈現(xiàn)典型的肝臟NASH改變，至造模12w呈現(xiàn)典型的肝纖維化的表現(xiàn)，病變特點(diǎn)和階段性與人體NFLD比擬性良好。 2．血生化分析：與對(duì)照組相比，HOMA_IR、HOMA_β均在造模2w開(kāi)始增加，且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，分別在12w、8w達(dá)高峰

5、，而DI水平在模型組呈下降趨勢(shì)。血清TC、ALT、GGT水平分別與IRI呈相關(guān)性(P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01)。 3．IR相關(guān)靶器官和組織觀測(cè)： (1)胰腺觀測(cè)： 1)β細(xì)胞胰島素的表達(dá)水平呈上升的態(tài)勢(shì)，在造模6w時(shí)表達(dá)顯著升高； 2)在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，β細(xì)胞的增生及凋亡共存，PCNA在造模2w時(shí)表達(dá)明顯增多，F(xiàn)as-L在造模8w表達(dá)明顯增強(qiáng)． 3)胰腺I(mǎi)SR、IRS在

6、造模早期變化不明顯，6w時(shí)表達(dá)顯著降低，且與血清。TNFα、瘦素負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；而胰島AKT在造模2w開(kāi)始表達(dá)明顯增多； 4)SOCS-3在胰島呈彌漫性表達(dá)，PPARγ主要分布在胰島中央部，分別在造模2w、4w時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)，二者均與ISR、IRS的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。 (2)肝臟觀測(cè)： 1)肝臟ISR、IRS的陽(yáng)性細(xì)胞以中央靜脈周?chē)鸀橹謩e在造模6w、8w時(shí)表達(dá)明顯減少。ISRmRNA的表

7、達(dá)先升高，在造模6w時(shí)達(dá)高峰后降低。 2)GLUT-4的蛋白表達(dá)變化與其mRNA的變化趨勢(shì)相一致，分別在造模4w、6w時(shí)表達(dá)明顯減少，并均與瘦素呈相關(guān)性(P＜0.05)。 3)SOCS-3主要表達(dá)在中央靜脈周?chē)?，造?w表達(dá)上調(diào)，造模6w達(dá)高峰，且與IRS負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。 4)肝臟SREBP-1c及PPARγ的表達(dá)均增多，前者以中央靜脈周?chē)鸀橹?，后者以匯管區(qū)周?chē)鸀橹?，分別在造模2w、8w表達(dá)明顯增加。

8、 (3)腹部脂肪組織觀測(cè)： 1)ISR、IRS、GLUT-4表達(dá)均降低，分別在造模6w、6w、8w時(shí)出現(xiàn)顯著性變化，且與血清TNFα水平負(fù)相關(guān)(P＜0.05)； 2)SOCS-3、SREBP-1c、PPARγ表達(dá)均增強(qiáng)，分別在2w、2w、6w時(shí)出現(xiàn)顯著性變化，其中SOCS-3與IRS負(fù)性關(guān)(P=0.05)； SREBP-1c與血清脂聯(lián)素、HDL、TC呈相關(guān)性(P＜0.05)。 結(jié)論: 1．成功制備具有

9、IR的NAFLD大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停饕±韺W(xué)改變、血生化變化與人體NAFLD比擬性良好，為NAFLD的發(fā)病機(jī)制的探討和藥物的實(shí)驗(yàn)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2．研究發(fā)現(xiàn)NAFLD大鼠在疾病過(guò)程中出現(xiàn)胰腺胰島β細(xì)胞的分泌亢進(jìn)、β細(xì)胞增生，是NAFLD發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中IR的適應(yīng)性改變；而胰島β細(xì)胞的凋亡推測(cè)可能為β細(xì)胞的過(guò)分泌及增生后的衰退性表現(xiàn)。 3．NAFLD大鼠胰腺組織存在胰島素信號(hào)蛋白ISR、IRS表達(dá)減少，脂源性激素TN

10、Fα、瘦素和SOCS-3可能對(duì)胰島素信號(hào)蛋白具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，同時(shí)誘導(dǎo)胰腺組織PPARγ表達(dá)上調(diào)，推測(cè)為NAFLD病理過(guò)程中機(jī)體的一種負(fù)反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。 4．動(dòng)態(tài)觀測(cè)結(jié)果顯示，NAFLD模型肝臟及腹部脂肪組織均發(fā)生IR，表現(xiàn)多種胰島素信號(hào)蛋白表達(dá)變化，其中ISR變化最早、且顯著，而PI3K的改變相對(duì)較遲，SOCS-3在肝臟、脂肪及胰腺組織中表達(dá)變化均較早，并與TNFα的表達(dá)相平行，肝臟及脂肪組織GLUT-4的表達(dá)均減少，尤以在肝