嘌呤P2X7受體通過PKC-GSK3β途徑介導(dǎo)乙醛誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的研究.pdf

1、背景：酒精性肝臟疾病是因長(zhǎng)期大量過度飲酒所導(dǎo)致的各種肝臟損害性疾病。在ALF發(fā)展過程中，活化的HSC是肝臟產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要靶細(xì)胞，乙醇的刺激性代謝物乙醛可使肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。隨著對(duì)嘌呤受體研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)嘌呤能P2X7受體亞型在纖維化疾病中發(fā)揮著重要作用，并且與肝臟疾病有著密切的聯(lián)系。P2X7受體是嘌呤受體家族中獨(dú)特的離子通道型受體，可激活鈣離子通道促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，并可促使組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生，

2、進(jìn)而導(dǎo)致肝臟疾病的發(fā)生。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分布廣泛，不僅能調(diào)節(jié)糖代謝反應(yīng)，還可以介導(dǎo)各種炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)生。目前有研究報(bào)道，抑制GSK-3β可明顯減少腎纖維化模型中膠原I的形成和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。激活P2X7受體可刺激PKC依賴性GSK3途徑的活化，再引起GSK3的磷酸化而發(fā)揮作用。
　　目的：通過建立乙醛誘導(dǎo)的HSC活化模型模擬酒精性肝纖維化離體模型。觀察嘌呤能P2X7受體在

3、HSC中的mRNA和蛋白表達(dá)情況，對(duì)細(xì)胞周期的影響，是否對(duì)各種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有所影響以及對(duì)AKT和ERK1/2的磷酸化水平是否有影響。同時(shí)探討P2X7受體對(duì)乙醛誘導(dǎo)的HSC活化過程中α-SMA和Collagen I的表達(dá)的影響，是否通過PKC-GSK3β信號(hào)通路產(chǎn)生作用。為預(yù)防與治療酒精性肝纖維化疾病提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：通過200μM乙醛刺激HSC48h建立HSC活化模型進(jìn)行模擬酒精性肝纖維化離體模型。采用Western

4、 blot和實(shí)時(shí)定量PCR觀察P2X7R的表達(dá)情況。采用P2X7R激動(dòng)劑/抑制劑、RNA干擾技術(shù)處理以及流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察P2X7受體對(duì)細(xì)胞周期的影響，采用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR觀察對(duì)炎癥因子（TNF-α，IL-6，IL-18和IL-1β）表達(dá)以及對(duì)α-SMA和Collagen I的表達(dá)的影響，并用Western blot觀察其對(duì)PKC-GSK3β信號(hào)通路的影響以及對(duì)pAKT和pERK1/2的影響。采用PKC激動(dòng)劑/P

5、KC抑制劑和GSK3β選擇性抑制劑分別觀察PKC與GSK3β在乙醛誘導(dǎo)的HSC活化過程中對(duì)α-SMA和Collagen I的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：在乙醛誘導(dǎo)的 HSC活化模型中，P2X7R表達(dá)較正常組顯著升高。采用P2X7R激動(dòng)劑BzATP可明顯升高細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例，炎癥因子（TNF-α，IL-6，IL-18和 IL-1β）和α-SMA和 Collagen I的表達(dá)。而采用 P2X7R抑制劑A438079和沉默P2X7R均可

6、明顯降低細(xì)胞周期，炎癥因子以及α-SMA和Collagen的表達(dá)。此外，BzATP亦可增加PKC和pGSK3β/GSK3β比值，A438079和沉默P2X7R則使PKC表達(dá)和pGSK3β/GSK3β比值明顯降低。此外，采用PKC激動(dòng)劑PMA/抑制劑SC-3088研究發(fā)現(xiàn)，PMA可促進(jìn)GSK3β磷酸化以及促進(jìn)α-SMA和Collagen I的表達(dá)，而SC-3088則相反地抑制GSK3β磷酸化并降低α-SMA和Collagen I的表達(dá)。G