小腸ICC的分離和培養(yǎng)及高糖對體外培養(yǎng)的Cajal間質(zhì)細胞P2X7嘌呤能受體表達的影響.pdf

1、研究背景：胃腸動力障礙是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的一個慢性并發(fā)癥，發(fā)病率較高。目前為止，其發(fā)病機制尚不明確，一般認為糖尿病胃動力障礙主要與DM自主神經(jīng)病變和胃腸激素失衡有關(guān)，而DM的代謝紊亂，特別是糖代謝紊亂可能是產(chǎn)生本癥的基礎(chǔ)。現(xiàn)在其治療限于對癥治療，效果欠佳。因此，進一步研究該病的發(fā)病機制及尋找更有效的治療方法或藥物意義重大。近年來越來越多的實驗證實Cajal間質(zhì)細胞（Interstitial Cells

2、of Cajal，ICC）與其關(guān)系密切，引起人們廣泛關(guān)注。而ICC的分離和體外培養(yǎng)一直是個難題，也就阻礙了相關(guān)研究的發(fā)展。嘌呤受體是一類非腎上腺能非膽堿能（non-adrenergic non-cholinergic，NANC）受體，P2X7受體是其中一個較為特殊的受體，它具有獨特的結(jié)構(gòu)和功能，已成為研究熱點。
　　 目的：建立穩(wěn)定的ICC分離和體外培養(yǎng)方法。觀察P2X7嘌呤能受體在體外培養(yǎng)的ICC的表達情況、高糖對ICC形態(tài)及

3、其ICC上P2X7嘌呤能受體的影響，探討P2X7嘌呤能受體在糖尿病胃腸功能紊亂發(fā)生機制中的作用。
　　 方法：無菌條件下取出小鼠小腸組織，聯(lián)合使用機械分離法和酶解法分離細胞，將細胞懸液接種于含有干細胞因子（stem cell factor，SCF）的M199培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，ICC特異的c-Kit抗體進行免疫熒光染色后，用激光共聚焦顯微鏡進行鑒定。在穩(wěn)定培養(yǎng)ICC的基礎(chǔ)上應(yīng)用ICC特異的c-Kit抗體和P

4、2X7受體抗體進行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下進行鑒定，以確定P2X7受體是否表達于ICC。實驗分組：正常對照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)，高糖組(葡萄糖濃度為33 mmol/L)。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，RT-PCR對P2X7和c-Kit受體表達進行比較。
　　 結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察到ICC核大,有多個突起并有次級分支,相互之間連接形成網(wǎng)絡(luò),c-kit抗體熒光染色呈陽性。激光共聚焦顯微鏡下P2X7受體在c-

5、Kit抗體陽性的細胞上的免疫熒光染色是陽性的；與正常組比較，加入葡萄糖后的ICC細胞變大，突起變短，與周圍細胞的網(wǎng)絡(luò)連接減少；RT-PCR結(jié)果顯示,加入高糖后的ICC的c-Kit受體表達減弱，而P2X7受體的表達是增強的。
　　 結(jié)論：ICC的分離和培養(yǎng)是個難題，實驗過程中我們對其方法、要點及注意事項進行了探討，并獲得了成功。P2X7受體表達于體外培養(yǎng)的ICC上，高糖使ICC的形態(tài)發(fā)生了改變、減弱了c-Kit的表達、加強了P2X