嘌呤受體P2X7和P2Y2在大鼠骨髓間充質干細胞成骨和成脂分化中的作用.pdf

1、目的：
　　探討嘌呤受體P2X7和P2Y2在大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨和成脂分化中的作用。
　　方法：
　　1.體外實驗
　　（1）受體表達檢測：免疫熒光染色檢測BMSCs上嘌呤受體P2X7和P2Y2的表達，RT-qPCR及Western-blot檢測受體表達與細胞分化狀態(tài)的關系；
　?。?）細胞增殖及活性檢測：CCK-8試劑盒檢測激活嘌呤受體P2X7和P2Y2對BMSCs增殖及細胞活性的影響；

2、
　　（3）成骨分化檢測：RT-qPCR及Western-blot檢測成骨指標（RUNX2，ALP及OPN）的表達；茜素紅染色檢測鈣結節(jié)形成；ALP（堿性磷酸酶）染色檢測ALP生成；
　　（4）成脂分化檢測：RT-qPCR及Western-blot檢測成脂指標（PPARγ，F(xiàn)ABP4及Adipsin）的表達；油紅O染色檢測脂滴生成；
　　（5）基因沉默技術：siRNA分別沉默P2X7和P2Y2受體，檢測嘌呤受體P2X7

3、和P2Y2在BMSCs成骨和成脂分化中的作用；
　　（6）信號通路檢測：Western-blot檢測激活嘌呤受體P2X7和P2Y2后其下游被激活的信號通路。
　　2.體內實驗
　?。?）動物模型：用小鼠卵巢切除骨質疏松模型研究在體內激活嘌呤受體 P2X7后對松質骨、皮質骨及髓腔內脂肪生成的影響；
　?。?）組織形態(tài)學分析：microCT檢測松質骨和皮質骨骨參數；H&E染色檢測松質骨骨參數和髓腔內脂滴形成。

4、　　結果：
　　1.SD大鼠BMSCs上表達嘌呤受體P2X7和P2Y2；在成骨分化過程中P2Y2受體表達逐漸減少，而P2X7受體表達逐漸增加；在成脂分化過程中P2Y2受體表達逐漸增多，而P2X7受體表達逐漸減少。
　　2. BzATP通過激活P2X7受體促進BMSCs成骨指標表達、ALP生成及鈣結節(jié)形成，抑制成脂指標表達及脂滴的形成。P2X7受體的siRNA和特異性拮抗劑（BBG）完全阻止了BzATP的作用。microCT顯

5、示BzATP可以減少因卵巢切除所致的松質骨丟失，但對皮質骨的參數沒有影響；H&E染色顯示BzATP可以增加卵巢切除小鼠的松質骨數目和體積，使骨髓腔內脂滴生成減少。
　　3. BzATP刺激使ERK1/2和JNK磷酸化增加，BBG抑制BzATP誘導的ERK1/2和JNK的磷酸化；阻滯ERK1/2和JNK信號通路后，BzATP對BMSCs成骨和成脂基因表達的影響消失。
　　4. UTP（三磷酸尿苷）通過激活P2Y2受體抑制BMS

6、Cs成骨指標表達、ALP生成及鈣結節(jié)形成，促進BMSCs成脂指標表達及脂滴的形成。
　　5. UTP刺激使ERK1/2磷酸化增加，P2Y2受體siRNA抑制UTP誘導的ERK1/2磷酸化；阻滯ERK1/2信號通路24h后，UTP對BMSCs成骨和成脂基因表達的影響消失。
　　結論：
　　1. BzATP通過P2X7受體激活ERK1/2和JNK信號通路，促進大鼠BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化；BzATP可以減少小鼠卵