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文檔簡介
1、脊髓缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷是引起胸主動(dòng)脈及脊柱手術(shù)后發(fā)生截癱的最主要原因。由于治療困難,致殘率與致死率非常高。目前關(guān)于脊髓I/R損傷病理學(xué)的確切機(jī)制仍不清楚,有研究表明同一系列復(fù)雜的病理過程有關(guān),包括:興奮性中毒,氧自由基的生成,炎癥和凋亡。因此,脊髓I/R損傷已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題和熱點(diǎn)。盡管目前使用很多策略來增加脊髓對(duì)缺血的耐受性,減少其神經(jīng)并發(fā)癥,但是臨床尚無治療截癱病人的
2、特效藥物,迫切需要找到一種有效的藥物治療方式。三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)作為第一信使參與信息傳遞,調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生化代謝與生理活動(dòng)。更重要的是,組織損傷時(shí)有大量ATP釋放,參與免疫和炎癥反應(yīng)。傳導(dǎo)ATP信號(hào)的受體分為P2X和P2Y受體兩類,其中P2X受體是配體門控的離子通道。P2X7受體是P2X受體第七個(gè)亞型,其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)倍受關(guān)注。高濃度ATP反復(fù)持續(xù)的激活可以使P2X7受體形成一個(gè)大的質(zhì)
3、膜孔道,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究表明,拮抗P2X7受體可以減輕大腦中動(dòng)脈閉塞引起的腦缺血再灌注損傷。P2X7受體在大鼠脊髓I/R損傷中的作用目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
目的:
1、建立穩(wěn)定的大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型
2、研究P2X7受體脊髓缺血再灌注損傷后在脊髓灰質(zhì)的表達(dá)變化。
3、研究拮抗P2X7受體后,是否可以減輕脊髓缺血再灌注損傷,并探討相關(guān)機(jī)制。
方法:
4、 1、運(yùn)用2F-Fogarty導(dǎo)管阻斷大鼠降主動(dòng)脈下段,結(jié)合全身低血壓,來建立穩(wěn)定的大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組,其他同手術(shù)組,但不誘導(dǎo)脊髓缺血。
2、脊髓缺血再灌注損傷后1d、3d、5d、7d,應(yīng)用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)功功能的改變;取脊髓L4-L6行Nissl染色評(píng)價(jià)脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量;運(yùn)用雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)鑒定P2X7受體的表達(dá);運(yùn)用Western-blot檢測(cè)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)P2X7受體在蛋白
5、水平上的變化。
3、在大鼠缺血再灌注15min后,股靜脈給予P2X7受體拮抗劑BBG(50mg/kg),術(shù)后第2d和3d連續(xù)給藥,共給藥3次;Saline組給予和BBG50組相同的劑量的生理鹽水。觀察術(shù)后4d、14d、21d,大鼠的運(yùn)動(dòng)功能的改善情況,然后行Nissl染色,雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué),檢測(cè)mRNA和蛋白水平上P2X7受體的變化。并初步探討P2X7的激活是否和炎癥信號(hào)途徑MAPK有關(guān)。
結(jié)果:<
6、br> 1、建立了大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型,實(shí)驗(yàn)中得出的模型成功復(fù)制的要點(diǎn):雌性SD大鼠260-300g,肛溫維持在35.9左右,術(shù)中大鼠的全身循環(huán)血壓維持在46mmHg左右,股動(dòng)脈血壓維持在7mmHg左右,缺血9min。
2、脊髓缺血再灌注損傷后1d,3d,5d,7d后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯障礙,同sham組比較,BBB評(píng)分有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),但是實(shí)驗(yàn)組間大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.
7、05)。隨著再灌注損傷時(shí)間的延長,大鼠的脊髓前角的正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,和sham組比,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),組間比較也有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示:脊髓缺血再灌注損傷后,P2X7受體只在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá),在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上未見明顯表達(dá)?;罨男∧z質(zhì)細(xì)胞存在于脊髓前角和背角的損傷部位。隨著再灌注時(shí)間的延長,脊髓損傷程度加重,小膠質(zhì)細(xì)胞的活化越多。同sham組比較,術(shù)后
8、第3d,小膠質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)大量明顯的激活。脊髓缺血再灌注后,星形膠質(zhì)細(xì)胞大量激活,1d有少量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,但是不明顯,到5d和7d時(shí)活化較為明顯,并且星形膠質(zhì)細(xì)胞只在損傷周圍活化,損傷部位無星形膠質(zhì)細(xì)胞。Western-blot結(jié)果顯示:從再灌注損傷1d開始到7d,P2X7受體的蛋白水平逐漸增加,7d表達(dá)最多,同sham組和其他實(shí)驗(yàn)組相比(P<0.05)。
3、給予拮抗劑BBG后,大鼠在術(shù)后4d,14,21d的運(yùn)動(dòng)功
9、能明顯改善,BBB評(píng)分同Saline組比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中第BBG50組第14d運(yùn)動(dòng)功能改善最為明顯,同BBG504d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。Nissl染色提示:給予拮抗劑BBG后脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多,同Saline組比較,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中14d的神經(jīng)元變化最明顯,同4d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示:同sham組相比,Sali
10、ne組P2X7受體的mRNA顯著增多,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),其中14d表達(dá)最多,同Saline組4d比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Saline組相比:BBG組大鼠P2X7受體的mRNA表達(dá)明顯下調(diào),有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),其中14d的下調(diào)較明顯,同BBG組4d比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western-blot結(jié)果顯示:給予拮抗劑BBG后,同Saline組比較,實(shí)驗(yàn)組P2X7受體的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)
11、,其中以14d最為明顯,同其他4d比較,(P<0.01);同Saline組比較:BBG組p-ERK1/2受體表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),其中以14d最為明顯,同4d比較(P<0.01)。雙重標(biāo)記的免疫熒光組織化學(xué)顯示:BBG組大鼠,14d小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓前角和背角的活化程度明顯減弱,活化范圍明顯減少,Iba1的熒光IOD與Saline組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。BBG50組大鼠,14d星形質(zhì)細(xì)胞在脊髓前角的熒光強(qiáng)度明顯減弱,
12、IOD與Saline組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Western-blot結(jié)果顯示:給予拮抗劑BBG后,同Saline組比較,實(shí)驗(yàn)組P2X7受體的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),其中以14d最為明顯,同其他實(shí)驗(yàn)組比較,(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組p-ERK1/2受體表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),其中以14d最為明顯,同其他實(shí)驗(yàn)組比較,(P<0.01)。
結(jié)論:
1、脊髓缺血再灌注引起的繼發(fā)性損傷和P2X7受體的
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