谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶Mu二價(jià)潛抑制劑設(shè)計(jì)、合成及表征.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶(glutathione-S-transferases，GST; EC2.5.1.18)催化還原型谷胱甘肽(GSH)和親電配體加合，廣泛分布于各種細(xì)胞中。其中人胞質(zhì)GSTs有α，μ，ω，π，θ，ζ六大類同工酶。腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)GST主要是同工酶π即hGSTP、α即hGSTA和μ即hGSTM;這些同工酶催化GSH與各種非營養(yǎng)物質(zhì)（包括細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物）生物轉(zhuǎn)化。hGSTP在多數(shù)耐藥實(shí)體瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其催化抗腫瘤藥物的生

2、物轉(zhuǎn)化及參與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制之一，其選擇性抑制劑可作為腫瘤化療增敏劑。在部分耐藥腫瘤細(xì)胞中，hGSTM被誘導(dǎo)表達(dá)，GSTM的選擇性抑制劑也有可能是強(qiáng)效的抗腫瘤藥物增敏劑。
　　GST是雙底物酶，每個(gè)活性中心有結(jié)合GSH的G位點(diǎn)及結(jié)合疏水底物的H位點(diǎn)。GST的單價(jià)產(chǎn)物同步結(jié)合在一個(gè)活性中心的G位點(diǎn)和H位點(diǎn)，故親和力常高于GSH或其底物。特別是，其二價(jià)抑制劑同步結(jié)合于兩個(gè)活性中心故親和力遠(yuǎn)高于單價(jià)抑制劑，這對(duì)于二價(jià)產(chǎn)

3、物型抑制劑理論上應(yīng)更明顯。但GST產(chǎn)物抑制劑親水性強(qiáng)且難合成，其潛抑制劑疏水性較高而易于透過細(xì)胞膜。所以，GST的二價(jià)潛抑制劑更有藥用潛力。本論文首先基于GST同工酶二聚體的活性中心距離及縫隙結(jié)構(gòu)差異，針對(duì)其二聚體的對(duì)稱雙活性中心，選擇不同長度柔性鏈鏈接雙疏水底物構(gòu)成雙價(jià)底物型抑制劑，設(shè)計(jì)一系列GSTM選擇性雙價(jià)底物型抑制劑:此類雙價(jià)底物型抑制劑分別含有可與GSH生成加合物的結(jié)構(gòu)單位，其自身疏水性較強(qiáng)而能有效透過細(xì)胞膜;在GST酶作用下

4、與GSH加合原位生成抑制作用更強(qiáng)但親水性增大的二價(jià)產(chǎn)物型抑制劑，其對(duì)應(yīng)底物型抑制劑為所設(shè)計(jì)二價(jià)潛抑制劑。
　　其次，在廣泛報(bào)道的GST抑制劑中，依他尼酸是典型的單價(jià)抑制劑，其抑制常數(shù)可以達(dá)到微摩爾級(jí)。本論文主要以依他尼酸的對(duì)-烷氧基苯丙烯酮結(jié)構(gòu)為基本母核，以線性短鏈二胺連接對(duì)-烷氧基苯丙烯酮結(jié)構(gòu)單元，合成得到對(duì)稱的二價(jià)GST抑制劑，并設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的單價(jià)抑制劑;分別表達(dá)純化hGSTM、hGSTA和hGSTP并測定抑制常數(shù)。酶反應(yīng)初速度法

5、初步證明所設(shè)計(jì)二價(jià)潛抑制劑原位生成產(chǎn)物對(duì)hGSTM表觀抑制常數(shù)可低于10 nM，為hGSTA和hGSTP表觀抑制常數(shù)的30％以下;動(dòng)力學(xué)研究表明屬于緩慢緊密結(jié)合型抑制劑。
　　GST二價(jià)抑制劑針對(duì)不同底物抑制類型不同，因而針對(duì)不同底物用傳統(tǒng)的雙倒數(shù)法所測得的抑制常數(shù)不同，不便于確定抑制劑的抑制效力。因此，本論文建立了兩種方法測定二價(jià)產(chǎn)物抑制劑的解離常數(shù)。非線性擬合酶活性抑制率對(duì)抑制劑濃度的響應(yīng)曲線得抑制劑的解離常數(shù);利用此類抑制劑