SGK-1在ALI肺泡上皮差異性表達(dá)及對(duì)ENaC表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、目的：以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為對(duì)象研究胰島素作用下肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)表達(dá)的變化及其可能機(jī)制，并觀察胰島素作用下對(duì)A549細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的凋亡的影響。進(jìn)一步通過(guò)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型研究胰島素作用下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清炎癥介質(zhì)的變化、對(duì)肺干濕重比的影響，及對(duì)肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道表達(dá)的調(diào)控及機(jī)制，了解胰島素對(duì)炎癥、肺水腫清除等方面的影響。
　　 方法：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：以A549細(xì)胞為對(duì)象，用含30U/L的胰島素

2、培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min和60 min，分別用蛋白免疫印跡法(Western blotting)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定ENaC-α及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK-1)的蛋白及mRNA表達(dá)，并使用白屈菜紅堿阻斷蛋白激酶C(PKC)抑制SGK-1后再次測(cè)定ENaC-α蛋白表達(dá)。用原位末端缺刻標(biāo)記法(TUNEL)測(cè)定經(jīng)胰島素處理后的A549細(xì)胞在缺氧條件下誘導(dǎo)凋亡，比較兩組凋亡率變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：72只成年健康SD

3、大鼠隨機(jī)分為3組，每組24只，經(jīng)腹腔注射麻醉(戊巴比妥鈉50mg/kg)(1)胰島素治療組(T組，24只)：大鼠麻醉后，經(jīng)頸靜脈插管按5mg/kg劑量注射LPS，兩小時(shí)后微量泵泵入含0.5U/ml胰島素的生理鹽水溶液1ml/h，術(shù)中監(jiān)測(cè)血糖，調(diào)節(jié)泵速使血糖在2.8-3.2mmol/l之間；(2)LPS模型組(L組，24只)：大鼠麻醉后，經(jīng)頸靜脈插管按5mg/kg劑量注射LPS，兩小時(shí)后微量泵泵入生理鹽水1ml/h；(3)對(duì)照組(C組，2

4、4只)：試驗(yàn)中單純給予生理鹽水，首次劑量1ml/kg，兩小時(shí)后微量泵持續(xù)泵入生理鹽水1ml/h。以首次注射后兩小時(shí)為0點(diǎn)，分別于0，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)抽取靜脈血后處死，取肺標(biāo)本。采集血清，測(cè)TNF-α、IL-1β水平。取右肺稱(chēng)濕質(zhì)量后，置70℃恒溫烤箱中，烘烤72 h至其質(zhì)量不再變化后測(cè)定肺臟干質(zhì)量，計(jì)算肺濕/干重比右肺組織用于測(cè)量肺干濕重比，一部分左肺組織福爾馬林固定，HE染色光鏡下觀察炎癥反應(yīng)情況及上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，按病理變

5、化評(píng)分，比較炎癥及損傷程度。其余肺組織勻漿，用western-blot法檢測(cè)肺組織中SGK-1表達(dá)的變化。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法測(cè)定ENaC及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK-1)的mRNA，了解其轉(zhuǎn)錄水平。
　　 結(jié)果：用胰島素培養(yǎng)30 min即明顯上調(diào)ENaC-α和SGK-1的蛋白和mRNA表達(dá)表達(dá)，并隨處理時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。胰島素還可以抑制缺氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡

6、(10.3％比21.6％，P<0.05)。若以未添加胰島素培養(yǎng)A549細(xì)胞蛋白表達(dá)量為100％，胰島素作用30min時(shí)ENaC-α、SGK-1蛋白表達(dá)量為124％、135％，60 min時(shí)ENaC-α、SGK-1蛋白表達(dá)量為186％、176％。胰島素治療后1小時(shí)組織病理學(xué)(4.30±1.6，5.10±1.9 P<0.05)、炎癥指標(biāo)(IL-1β26.27±6.67，31.5±7.78P<0.05；TNF-α243.1±54.65，291

7、.71±63.56 P<0.05；IL-8，451.53±41.19，538.29±45.14P<0.05；PCT570.96±46.88，525.91±32.17P<0.05)、肺濕/干重比(5.33±1.57，6.32±1.35 P<0.05)，有明顯好轉(zhuǎn)，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肺損傷模型建立后，ENaC和SGK-1與對(duì)照組比較，表達(dá)明顯下降，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，經(jīng)胰島素治療后SGK-1的蛋白表達(dá)增高，SGK-1與