胃癌外泌體miRNA表達(dá)差異性研究.pdf

1、研究目的：
　　檢測(cè)臨床胃癌病人血清外泌體miRNA(Serum Exosomal microRNAs)表達(dá)譜，比較Exosome在不同分期胃癌中的分子差異，在此基礎(chǔ)上，評(píng)估血清外泌體miRNA作為診斷標(biāo)志物的意義，探討利用Exosome分子特征評(píng)估胃癌患者的轉(zhuǎn)移潛能的作用，進(jìn)一步分析特異血清外泌體miRNA水平與腫瘤生物學(xué)行為及臨床特點(diǎn)間的關(guān)系。
　　研究方法：
　　(1)病例選擇:依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，

2、選取2016年3月1日起的長(zhǎng)海醫(yī)院胃腸外科收治的胃癌患者。(2)標(biāo)本采樣:于術(shù)前晨6時(shí)用采血針和分離膠促凝管抽取外周血，使用離心機(jī)分離血清(2ml)，-80℃凍存，干冰運(yùn)輸。(3)樣本檢測(cè):使用RiboTM Exosome Isolation Reagent for plasma or serum分離血清外泌體。采用Magen試劑盒進(jìn)行樣品抽提，并用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop進(jìn)行樣品質(zhì)檢

3、，A260:A280＞1.8，A260:A230＞2.2為質(zhì)檢通過(guò)的樣品。(4)建立文庫(kù):質(zhì)檢通過(guò)的樣品，以1ug起始量，用TruSeq(@)Small RNA Sample Prep Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并用Agilent2200TapeStation進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，片段平均長(zhǎng)度140-170bp為質(zhì)檢通過(guò)的文庫(kù)。(5)上機(jī)測(cè)序:通過(guò)質(zhì)檢的文庫(kù)，按照HiSeq2500User Guide中所述的方法進(jìn)行上機(jī)樣本制備，上機(jī)樣本的終濃度為1

4、0pM。使用Single Read Flow Cell，按照HiSeq2500User Guide的指示進(jìn)行HiSeq2500上機(jī)操作，并運(yùn)行single-end(1×50)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序程序。(6)數(shù)據(jù)分析:測(cè)序程序運(yùn)行完畢，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立exsomal miRNA表達(dá)譜。使用SPSS18.0軟件中t檢驗(yàn)或方差方法分析exosome總量及不同miRNA表達(dá)差異與腫瘤臨床特點(diǎn)間的關(guān)系。根據(jù)臨床特點(diǎn)分組后，使用PCA分析、D

5、Eseq、EdgeR方法確定差異表達(dá)miRNA，使用GO及KEGG對(duì)其靶基因進(jìn)行富集分析。
　　研究結(jié)果：
　　PCA分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)分組及TNM分期分組與樣本中已知miRNA表達(dá)水平不想關(guān)。結(jié)合PCA方法重新分組，對(duì)比4例晚期及5例早期病例，發(fā)現(xiàn)55個(gè)差異表達(dá)的miRNA，DEseq方法發(fā)現(xiàn)39個(gè)差異表達(dá)miRNA，EdgeR發(fā)現(xiàn)52個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中36個(gè)為重疊miRNA。靶基因GO分析結(jié)果顯示靶基因富集于mRNA