microRNA-7-5p通過mTORC2-SGK-1信號通路調(diào)控人肺泡上皮細胞鈉離子通道作用機制的研究.pdf

1、研究背景：目前認為，通過上調(diào)肺泡上皮鈉離子通道（ENaC）的表達可以增加Na+的轉(zhuǎn)運，為肺泡液體清除（alveolar fluid clearance，AFC）提供驅(qū)動力，減輕肺水腫，從而使急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者受益?，F(xiàn)已闡明，ENaC主要受mTORC2/SGK-1信號通路的調(diào)控。MicroRNA(miRNA)是非編碼微小RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其

2、目的mRNA的翻譯過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p參與了腫瘤細胞中mTOR的調(diào)控，但是在人肺泡上皮細胞中miRNA-7-5p調(diào)控ENaC的機制并不清楚，其能否在ARDS時影響ENaC的表達水平亦未見有報道。
　　目的：探討miRNA-7-5p通過mTORC2/SGK-1信號通路對人肺泡上皮鈉離子通道的調(diào)控機制。再進一步揭示急性呼吸窘迫綜合癥時人肺泡上皮 miRNA-7-5p的表達變化與其在肺泡液體清除過程中起到的作用。由此

3、豐富 ARDS發(fā)病機制的分子生物學理論，并為該疾病的臨床治療提供新的線索。
　　方法：
　　本研究由三部分組成
　　第一部分：雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miRNA-7-5p靶基因
　　首先通過重組DNA質(zhì)粒構(gòu)建psiCHECK2-mTOR、psiCHECK2-mTOR-mut、psiCHECK2-SGK-1、psiCHECK2-SGK-1-mut共四組mRNA3’-UTR中含有或不含miRNA-7-5p靶序列的重

4、組報告基因。然后通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分別證實mTOR、SGK-1是否均為miRNA-7-5p的靶基因。
　　第二部分：miRNA-7-5p調(diào)控人肺泡上皮細胞ENaC的機制研究
　　轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p mimic上調(diào)肺泡上皮miRNA-7-5p表達水平后，qRT-PCR檢測實驗各組 miRNA-7-5p、mTOR mRNA、SKG-1 mRNA表達水平，了解miRNA-7-5p對 mTOR mRNA、SKG-1 m

5、RNA的靶作用。再應用免疫印跡法(Western blotting)檢測各組mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表達水平，探索 miRNA-7-5p對 mTORC2/SGK-1信號通路活性的調(diào)控作用。最后驗證miRNA-7-5p對ENaC各亞基表達水平的影響。
　　第三部分：miRNA-7-5p對LPS誘導下人肺泡上皮細胞ENaC的調(diào)控機制研究
　　使用LPS刺激A549細胞以模擬ARDS時的病

6、理狀況，分別在0，3，6，12，24小時利用qRT-PCR檢測細胞內(nèi)miRNA-7-5p的變化情況。使用LPS刺激12小時后，轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p inhibitor下調(diào)miRNA-7-5p表達，再通過qRT-PCR檢測mTOR與SGK-1的mRNA表達水平，免疫印跡法檢測各組mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表達水平，探討抑制 miRNA-7-5p的表達在 ARDS時對mTORC2/SGK-1信號通

7、路活性的調(diào)控作用。最后繼續(xù)應用免疫印跡法、免疫熒光顯微鏡檢測miRNA-7-5p對LPS誘導下ENaC-α、β、γ三個亞基與mTOR、SGK-1的表達影響。
　　結(jié)果：
　　1.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miRNA-7-5p靶基因
　　通過TargetScan預測發(fā)現(xiàn)mTOR與SGK-1的3’-UTR內(nèi)都有miRNA-7-5p的靶點序列。分別構(gòu)建mTOR與SGK-1 mRNA3’-UTR中含有miRNA-7-5p靶序列

8、的野生型和突變型報告基因載體，與miRNA-7-5p mimic或miRNA-7-5p negative control共轉(zhuǎn)染A549細胞后進行雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p對于psiCHECK-2-mTOR的熒光表達有非常顯著的抑制作用，相對熒光強度下降至57%±5%(7.11±0.64與12.50±0.99)，與陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而miRNA-7-5p對psiCHECK-2-mTOR

9、-mut的熒光表達沒有明顯抑制作用(P＞0.05)。我們還發(fā)現(xiàn)在建立的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)中，miRNA-7-5p對于psiCHECK-2-SGK-1的熒光表達也具有非常顯著的抑制作用，相對熒光強度下降至45%±4%(5.12±0.46與11.49±1.48)，與陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但是miRNA-7-5p對psiCHECK-2-SGK-1-mut的熒光表達則沒有明顯抑制作用(P＞0.05)。
　　

10、2. miRNA-7-5p調(diào)控人肺泡上皮細胞ENaC的機制研究
　　A549細胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p mimic與negative control后，通過qRT-PCR實驗我們發(fā)現(xiàn)，miRNA-7-5p mimic轉(zhuǎn)染組中mTOR的mRNA表達水平較空白對照組和negative control組出現(xiàn)了明顯的降低，其表達水平僅為空白對照組的0.54倍（P＜0.01）；SGK-1的mRNA表達水平較空白對照組和negative

11、 control組也出現(xiàn)了明顯的降低，其表達水平低至空白對照組的0.30倍（P＜0.01）。接下來通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，mTOR與 SGK-1的蛋白表達同樣出現(xiàn)了降低(P＜0.01)，同時，mTORC2下游磷酸化產(chǎn)物 p-Akt-Ser473的表達降低(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，miRNA-7-5p能夠在細胞內(nèi)抑制 mTORC2/SGK-1信號通路的活性。然后應用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-7-5p

12、mimic轉(zhuǎn)染組ENaC-α、β、γ三個亞基的表達較空白組均出現(xiàn)了降低(P＜0.01)，這提示 miRNA-7-5p在肺泡上皮細胞內(nèi)能夠通過mTORC2/SGK-1信號通路夠抑制ENaC的表達。
　　3.miRNA-7-5p對LPS誘導下人肺泡上皮細胞ENaC的調(diào)控機制研究
　　發(fā)現(xiàn)自100 ng/ml濃度LPS誘導后6小時開始miRNA-7-5p的表達就開始升高（P＜0.05），且隨時間推移，其表達呈逐漸上升的改變，分別為

13、LPS誘導開始時的1.4、1.9與2.8倍（P＜0.05）。這說明ARDS時，肺泡上皮細胞內(nèi)miRNA-7-5p的表達有明顯升高。向LPS刺激后的A549細胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-7-5p inhibitor與negative control，發(fā)現(xiàn)mTOR與SGK-1的mRNA表達水平較LPS組與LPS+negative control組均出現(xiàn)了明顯的回升(P＜0.01)。Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，mTOR，SGK-1與 p-Ak

14、t-Ser473的蛋白表達也分別出現(xiàn)了升高(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，降低miRNA-7-5p的表達能夠在ARDS時恢復mTORC2/SGK-1信號通路的活性。同時Western blot實驗與免疫熒光顯微鏡成像都證明ENaC亞基表達水平較單純LPS組均出現(xiàn)了明顯的恢復(P＜0.01)。這提示通過降低肺泡上皮細胞miRNA-7-5p的表達能夠提高ENaC的穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)ARDS時低下的ENaC表達，從而可能起到增強肺水清除的效果。