脂多糖對(duì)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氯離子通道TMEM16A表達(dá)影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung iniury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)是心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸功能不全或衰竭。其臨床表現(xiàn)主要為難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺動(dòng)脈高壓而體循環(huán)低血壓。死亡率50％。急性肺損傷的病理生理特點(diǎn)之一是肺的滲透性水腫。已知肺泡上皮細(xì)胞在肺水清除過程中起到了重要的作用。目前認(rèn)為肺泡Ⅰ型上

2、皮細(xì)胞(Alveolarepithelial cells typeⅠ，AIⅠ)和Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar epithelial cellstypeⅡ，ATⅡ)在肺液清除中起著互相補(bǔ)充的作用，Ⅰ型上皮細(xì)胞在基本的肺液清除中發(fā)揮作用，Ⅱ型上皮細(xì)胞在增強(qiáng)清除方面發(fā)揮作用。而肺泡細(xì)胞膜表面的離子通道與肺水清除有著密切聯(lián)系。雖然鈉離子通道是肺水清除的主要?jiǎng)恿Γ罅垦芯匡@示肺泡液體清除是包括鈉、氯、水等多種離子通道形成的復(fù)雜轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)狀體系。氯離

3、子通道(chloride channels)在生物體內(nèi)含量很豐富，但卻一直被人們忽視，直到近年來才逐漸被關(guān)注。已有文獻(xiàn)證明囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子氯通道(CFTR)是對(duì)肺水清除存在一定作用的離子通道，如果缺失或出現(xiàn)功能障礙則可能致使肺泡內(nèi)水腫液的清除阻礙。已有實(shí)驗(yàn)及臨床證據(jù)證明，cAMP激動(dòng)劑可加速肺水清除，而CFTR是這一過程所必需的。
　　本實(shí)驗(yàn)選用TMEM16A為研究對(duì)象。TMEM16A基因是TMEM家族的一員，已經(jīng)研究證實(shí)

4、其在感覺神經(jīng)元，上皮細(xì)胞，食管癌、膀胱癌及乳腺癌中均有表達(dá)。Caputo A等于2008年證實(shí)TMEM16A為鈣激活的氯離子通道蛋白，近期有研究表明其與氣道的粘液腺體分泌相關(guān)。目前肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上TMEM16A表達(dá)及其與急性肺損傷時(shí)肺水清除的關(guān)系還未引起足夠重視，本實(shí)驗(yàn)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)復(fù)制急性肺損傷時(shí)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞體外損傷模型，在獨(dú)立環(huán)境下研究肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上TMEM16A表達(dá)情況及其與急

5、性肺損傷時(shí)肺水清除的關(guān)系。
　　方法：選取清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠12只，體重220±10g。腹腔麻醉后，氣管切開并插管，經(jīng)右心房穿刺，分別經(jīng)肺動(dòng)脈及經(jīng)氣管插管灌洗肺臟。心肺整體迅速從胸腔取出體外，注入胰蛋白酶和膠原酶混合液37℃水浴消化20分鐘。消化后剪碎肺組織，用細(xì)胞篩過濾，離心棄上清。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。用大鼠IgG免疫粘附法純化細(xì)胞。臺(tái)盼蘭測細(xì)胞活力，用電鏡及AKP染色的方法鑒定肺泡Ⅱ型上

6、皮細(xì)胞。用AKP染色的方法測定肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞純度。
　　建立脂多糖對(duì)體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞直接損傷模型，分組加入脂多糖。電鏡觀察比較正常及損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，以確定急性肺損傷造模成功。用ELISA的方法檢測各組細(xì)胞上清液中IL-1β表達(dá)水平。用Westren blot法檢測各組ATⅡ上TMEM16A蛋白表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果：
　　1肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)，鑒定及活力測定：細(xì)胞純化前每只大鼠可得細(xì)胞(4

7、.50±1.12)×107個(gè)每只大鼠，用臺(tái)盼藍(lán)檢測細(xì)胞活力為(92.08±5.18)％；細(xì)胞純化后每只大鼠可得細(xì)胞(1.55±0.41)×107個(gè)，細(xì)胞活力為(90.1±5.10)％。AKP染色法檢測純化后細(xì)胞純度為(79.17±3.07)％。電鏡檢測可證實(shí)為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞并確定急性肺損傷造模成功。
　　2用ELISA的方法檢測脂多糖損傷細(xì)胞的上清液中IL-1β表達(dá)水平結(jié)果
　　3空白對(duì)照組細(xì)胞上清液IL-1β濃度為(14

8、.50±2.24)pg/mL，模型組IL-1β濃度(38.55±15.07)pg/mL。模型組IL-1β濃度高于空白對(duì)照組，P＜0.05。
　　4用Western blot法檢測各組ATⅡ上TMEM16A蛋白水平的差異結(jié)果。
　　5蛋白印記結(jié)果，正常組(0.99±0.26)LPS組(1.00±0.11)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05，尚不能認(rèn)為兩組細(xì)胞中TMEM16A蛋白含量不同。
　　結(jié)論：
　　1本實(shí)驗(yàn)的原代大

9、鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離提純方法可以得到足夠純度和活力的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，以進(jìn)行對(duì)其體外干預(yù)造模的下一步實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用脂多糖成功復(fù)制體外干預(yù)下急性肺損傷模型。
　　2脂多糖單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可直接損傷細(xì)胞，并可使細(xì)胞上清夜中IL-1β表達(dá)水平增加
　　3脂多糖體外干預(yù)損傷組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞與正常組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中TMEM16A蛋白表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡苡捎谥嗵窃斐傻捏w外肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷不能使TMEM1