依普拉芬對(duì)體外雞胚小腸上皮細(xì)胞新型鈣離子通道表達(dá)的影響.pdf

1、試驗(yàn)Ⅰ、雞胚小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：培養(yǎng)雞胚小腸上皮細(xì)胞。方法：從18日齡雞胚中取一段十二指腸段，用組織塊培養(yǎng)法和以50μg·mL-1嗜熱菌蛋白酶與0.2 mg·mL-1膠原酶Ⅰ型聯(lián)合消化獲取的腸隱窩，在37.5℃、5％CO2的條件下，用含5％胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞。用差速消化法和差速貼壁法，進(jìn)一步純化、傳代。采用形態(tài)學(xué)觀察、Giemsa染色和免疫化學(xué)染色法進(jìn)行小腸上皮細(xì)胞鑒定。結(jié)果：組織塊培養(yǎng)法和酶聯(lián)

2、合消化培養(yǎng)法都可以得到雞胚小腸上皮細(xì)胞，純化后純度理想。結(jié)論：雞胚小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)成功，培養(yǎng)的細(xì)胞純度理想，為下一步研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　 試驗(yàn)Ⅱ、依普拉芬對(duì)雞胚小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 目的：在建立雞胚小腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，研究依普拉芬對(duì)雞胚小腸上皮細(xì)胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代小腸上皮細(xì)胞接種于96孔板，添加含1％FBS的DMEM對(duì)照組和含不同濃度的依普拉芬實(shí)驗(yàn)組，7

3、2 h后分別用MTT法、PNPP法測(cè)定小腸上皮細(xì)胞增殖率和小腸上皮細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性。結(jié)果：（1）與對(duì)照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-1的依普拉芬均顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖（P<0.01）；10-5 mol·L-1依普拉芬顯著抑制小腸上皮細(xì)胞的增殖（P<0.01）；（2）與對(duì)照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-1依普拉芬極顯著

4、促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞ALP活性（P<0.01），10-9mol·L-1顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞ALP活性（P<0.05）；10-5 mol·L-1的依普拉芬顯著抑制小腸上皮細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P<0.01）。結(jié)論：依普拉芬能顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的增殖；使小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的ALP顯著增加；但依普拉芬濃度越大，其上皮細(xì)胞則呈現(xiàn)明顯的抑制作用。
　　 試驗(yàn)Ⅲ、依普拉芬對(duì)雞胚小腸上皮細(xì)胞鈣離子通道基因表達(dá)的影響
　　 目的：在建立雞胚小腸上

5、皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，研究TRPV6在小腸上皮細(xì)胞上表達(dá)的定位以及依普拉芬對(duì)TRPV6、CaBP-D28k和PM0Alb mRNA表達(dá)的影響。方法：免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究TRPV6表達(dá)定位；用含10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-8 mol·L-1、10-9 mol·L-1和10-10 mol·L-1不同濃度的依普拉芬以及含1％FBS的DMEM對(duì)照組處理第二代雞胚小腸上皮細(xì)胞72 h后，用RT-PCR方法檢測(cè)其

6、TRPV6、CaBP-D28k和PMCAlbmRNA表達(dá)量變化。結(jié)果：（1）TRPV6表達(dá)定位于雞胚小腸上皮細(xì)胞胞膜上；（2）與對(duì)照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-8 mol·L-1依普拉芬顯著上調(diào)PMCAlb和CaBP-D28k mRNA的表達(dá)（P<0.01），10-9 mol·L-1依普拉芬作用下TRPV6的表達(dá)出現(xiàn)明顯上升（P<0.05），10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-