MicroRNA在無瘢痕和糖尿病創(chuàng)口愈合中的功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)重要的基因調(diào)控分子,參與多種病理生理學(xué)過程,影響細(xì)胞增殖、凋亡、器官發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展等。本研究主要是揭示miRNA分子及其合成通路中的關(guān)鍵基因在胚胎無瘢痕愈合表型和糖尿病皮膚創(chuàng)口延遲愈合過程中的表達(dá)和生物學(xué)作用。
　　 第一部分
　　 目的:本研究旨在通過對胚胎E16和E19天皮膚中miRNA表達(dá)譜檢測,尋找差異表達(dá)的miRNA分子并分析其生物學(xué)功能,初步揭示miRN

2、A分子在無瘢痕愈合皮膚表型和表型轉(zhuǎn)變過程中的作用,為進一步揭示胚胎無瘢痕愈合的分子機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：分別取孕中(E16)和晚(E19)期胎鼠皮膚,利用miRNA表達(dá)譜芯片檢測兩者之間差異表達(dá)的miRNA分子,并經(jīng)定量RT-PCR驗證。應(yīng)用相關(guān)軟件(miGator、TargetScanMouse Custom)對所有差異表達(dá)的miRNA進行靶基因預(yù)測。應(yīng)用生物信息學(xué)平臺DAVID對所有可能的靶基因進行基因注釋和信號通路分

3、析。體外應(yīng)用化學(xué)合成的miRNA模擬物和抑制劑進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,對miRNA分子(miR-29)的部分靶基因進行實驗驗證。另外,應(yīng)用western blot對于孕中晚期皮膚中miRNA合成通路中關(guān)鍵酶Drosha和Dicer蛋白進行檢測。
　　 結(jié)果：E16和E19胎鼠皮膚miRNA表達(dá)譜結(jié)果顯示共有16個差異表達(dá)的miRNA分子(2倍差異以上,P<0.05),其中11個高表達(dá)、5個低表達(dá)。應(yīng)用定量PCR驗證其中差異最大miR-29

4、b和miR-29c兩個miRNA分子,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與芯片結(jié)果相符。預(yù)測差異表達(dá)miRNA分子共計有1178個可能的靶基因,進一步進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述靶基因參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程,且高度富集于多個重要信號傳導(dǎo)通路,包括TGF-β、Wnt等。E19天胎鼠皮膚中Dicer蛋白含量明顯高于E16天胎鼠皮膚,而前者Drosha蛋白含量明顯高于后者。
　　 結(jié)論：1,胚胎中晚期皮膚中差異表達(dá)的miRNA分子在維持無瘢痕愈合表型和表型轉(zhuǎn)變及

5、皮膚無瘢痕愈合具有重要調(diào)節(jié)作用。2,差異表達(dá)miRNA可能是通過調(diào)控眾多的靶基因來參與生物學(xué)過程,影響多個信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。3,差異表達(dá)的miR-29b/c可能通過調(diào)節(jié)皮膚中多種膠原分子表達(dá)發(fā)揮其生理作用。4,孕中晚期皮膚中差異表達(dá)的Drosha和Dicer可能是引起miRNA差異表達(dá)的分子機制之一。
　　 第二部分
　　 目的:本研究旨在通過對糖尿病皮膚及創(chuàng)口愈合過程中miRNA合成通路中重要分子表達(dá)和功能分析,

6、來初步揭示miRNA分子及其合成通路在糖尿病皮膚創(chuàng)口延遲愈合過程中作用及機制。
　　 方法：以腹腔注射鏈佐菌素建立糖尿病大鼠動物模型,通過定量RT-PCR檢測皮膚及創(chuàng)口愈合過程中miRNA合成相關(guān)基因表達(dá)變化。對皮膚成纖維細(xì)胞予以高糖(25mmol/L)和低糖(5.5mmol/L)培養(yǎng),檢測Dicer表達(dá)變化。通過體外siRNA轉(zhuǎn)染、免疫熒光、MTT及流式細(xì)胞術(shù)揭示Dicer基因沉默對皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　

7、 結(jié)果：miRNA合成相關(guān)基因(Drosha、DGCR8、Exportin-5、Dicer、Agonaute-2)在糖尿病大鼠皮膚表達(dá)量均高于對照組。Dicer在糖尿病和對照組創(chuàng)口愈合過程第3、6天差異表達(dá)顯著。體外研究發(fā)現(xiàn)高糖能增強成纖維細(xì)胞中Dicer的表達(dá),而Dicer沉默能促進成纖維細(xì)胞增殖和抑制凋亡。
　　 結(jié)論：糖尿病影響皮膚及創(chuàng)口愈合過程中的miRNA的生物合成,影響特定miRNA分子表達(dá)量,可能是創(chuàng)口延遲愈合的