MicroRNA let-7f調(diào)節(jié)1型糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病的多種并發(fā)癥與組織缺血所致的延遲修復(fù)有關(guān)，是影響糖尿病患者生活質(zhì)量和預(yù)后的重要因素。組織缺血后的修復(fù)是一個(gè)涉及到多種細(xì)胞和分子參與的復(fù)雜過程，其中血管新生起著重要的作用。血管新生受到來自周圍微環(huán)境的正向和負(fù)向調(diào)控信號的嚴(yán)密調(diào)控，但這種平衡在糖尿病狀態(tài)時(shí)發(fā)生改變，導(dǎo)致糖尿病患者某些器官缺血之后的血管新生受損，從而引起組織修復(fù)的延遲。因此，恢復(fù)正常的血管新生功能已成為治療糖尿病患者并發(fā)癥的一種很有潛力的治療策

2、略。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是在血管新生中起著關(guān)鍵作用，它的作用包括兩個(gè)方面，一是通過分泌促血管生成的調(diào)控因子促進(jìn)血管新生，二是直接整合到新生血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中參與血管生成。近年來，EPCs的細(xì)胞治療已經(jīng)成為具有潛在臨床價(jià)值的治療糖尿病血管并發(fā)癥的重要策略。然而，臨床研究結(jié)果表明，糖尿病患者自體細(xì)胞移植的療效低于非糖尿病患者，其原因是糖尿病患者體內(nèi)的EPCs功能已明顯受

3、損，但到目前為止，糖尿病。EPCs功能受損的分子機(jī)制仍未闡明。因此，進(jìn)一步明確糖尿病EPCs功能受損的分子機(jī)制，尋求改善EPCs功能的方法，對于治療糖尿病并發(fā)癥具有重要的臨床意義。
　　 最近，microRNAs(miRNAs)作為新的血管新生的調(diào)節(jié)因子日益受到重視，已證實(shí)miRNA let-7f可促進(jìn)成熟內(nèi)皮細(xì)胞所介導(dǎo)的血管新生，但miRNA let-7f對于調(diào)節(jié)糖尿病EPCs功能的作用和機(jī)制尚未見報(bào)道。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，l

4、et-7f在EPCs中有很高的表達(dá)，且可調(diào)節(jié)EPCs內(nèi)AMP激活的蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)的活性和銜接蛋白p66shc的蛋白表達(dá)水平。因此，本課題旨在探討miRNA let-7f對糖尿病EPCs功能的調(diào)節(jié)作用，并探討AMPK和p66shc在let-7f調(diào)節(jié)EPCs功能中所起的作用。
　　 研究目的：
　　 1.研究miRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表達(dá)

5、變化及其對糖尿病EPCs功能的調(diào)節(jié)作用；
　　 2.研究AMPK對1型糖尿病小鼠EPCs功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制；
　　 3.探討AMPK和p66shc在let-7f調(diào)節(jié)EPCs功能中所起的作用。
　　 研究方法：
　　 1.動物模型野生型(wild-type)C57BL/6雄性小鼠(8-10周齡)，連續(xù)五天腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，對照組小鼠腹腔注射枸櫞酸

6、鈉緩沖液。末次注射后3-4天測定血糖濃度，篩選出血糖在280 mg/dL以上者作為1型糖尿病動物模型，之后隔天監(jiān)測血糖，待血糖持續(xù)升高4-6周后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.EPCs的分離培養(yǎng)及鑒定無菌分離實(shí)驗(yàn)小鼠股骨、脛骨、髖骨及肱骨，收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞按照1×106/cm2的密度接種在已包被玻連蛋白(vitronectin)的六孔板中，置于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后第一次完全換液，以去除未貼壁的細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)3天，

7、即可用于實(shí)驗(yàn)。為了鑒定EPCs，細(xì)胞培養(yǎng)7天后，用Dil-acLDL、isolectin和Hoechst33258進(jìn)行染色并在熒光顯微鏡下觀察。為了進(jìn)一步鑒定EPCs，對培養(yǎng)7天的細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面干細(xì)胞表面標(biāo)記物Sca-1和CD34、內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物VEGFR2(Flk-1)和VE-Cadherin(CD144)及單核細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b的表達(dá)，并與新鮮分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　 3.EPCs的功能檢

8、測通過檢測小管形成試驗(yàn)(tube formation assay)、細(xì)胞黏附試驗(yàn)(adhesion assay)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(migration assay)檢測EPCs的小管形成能力、黏附能力及遷移能力。
　　 4.Real-time PCR使用mirVanaTM miRNA提取試劑盒提取EPCs中的miRNAs，并用Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后使用TaqmanmiRNA引物和TaqMan Un

9、iversal PCR Master Mix檢測EPCs中l(wèi)et-7f的表達(dá)，并以snoRNA55作為內(nèi)參照。
　　 5.Western Blot利用特異性的抗體檢測EPCs內(nèi)p-thr172-AMPK、p-ser79-ACC、MnSOD、PP2A以及p66shc的蛋白表達(dá)，在Odyssey圖象分析儀上掃描，并用Quantity-One圖象分析軟件進(jìn)行條帶灰度掃描計(jì)算積分光密度值。
　　 6.Let-7f模擬物、抑制物和

10、siRNAs的轉(zhuǎn)染利用DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑Ⅰ對EPCs分別轉(zhuǎn)染let-7f模擬物、抑制物、MnSODsiRNA、PP2AsiRNA以及各自的隨機(jī)對照。
　　 7.腺病毒的轉(zhuǎn)染分別用50MOI的Ad-AMPK-DN轉(zhuǎn)染EPCs抑制AMPK的活性，用10MOI Ad-p66shcRNAi轉(zhuǎn)染EPCs抑制p66shc的蛋白表達(dá)，并以Ad-β-gal轉(zhuǎn)染作為對照。
　　 8.MnSOD活性的測定利用SOD活性檢測試劑盒檢

11、測EPCs內(nèi)MnSOD的活性。
　　 9.線粒體內(nèi)ROS的檢測用MitoSOX線粒體氧自由基熒光探針對EPCs進(jìn)行孵育，然后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量以檢測EPCs線粒體內(nèi)的ROS含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.MiRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表達(dá)水平顯著降低，降低血糖可恢復(fù)其表達(dá).與正常對照組小鼠分離培養(yǎng)的骨髓EPCs相比，1型糖尿病小鼠EPCs中miRNA let-7f的表達(dá)水平明顯降低，應(yīng)用胰

12、島素治療降低糖尿病小鼠血糖后，let-7f表達(dá)水平升高，而晚期糖基化終末產(chǎn)物、Ly83583和過氧化氫作用于EPCs后對let-7f的表達(dá)水平無影響。
　　 2.MiRNA let-7f改善1型糖尿病小鼠EPCs受損的功能。通過let-7f模擬物轉(zhuǎn)染糖尿病EPCs使let-7f在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，糖尿病EPCs受損的功能明顯改善，表現(xiàn)為小管形成能力、黏附能力和遷移能力的增加。相反，在正常EPCs中轉(zhuǎn)染let-7f抑制物后let-7f

13、的正常表達(dá)被抑制，正常EPCs形成小管的能力、黏附能力和遷移能力明顯下降。
　　 3.AMPK通過上調(diào)MnSOD而起到保護(hù)1型糖尿病EPCs功能的作用。Western Blot的結(jié)果表明，1型糖尿病小鼠EPCs中AMPK的活性降低，應(yīng)用AMPK特異性激活劑AICAR后可恢復(fù)EPCs的功能，上調(diào)糖尿病EPCs中已降低的MnSOD活性，并抑制線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。在用AIACR處理糖尿病EPCs之前，先用MnSODsiRNA轉(zhuǎn)染抑制

14、EPCs內(nèi)MnSOD的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AICAR恢復(fù)EPCs功能的作用顯著減弱。
　　 4.抑制1型糖尿病EPCs中的PP2A可增加細(xì)胞內(nèi)AMPK的活性。WesternBlot結(jié)果顯示，對AMPK活性有抑制作用的蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase2A，PP2A)在1型糖尿病小鼠EPCs中的表達(dá)升高，用PP2AsiRNA和PP2A抑制劑軟海面酸作用于糖尿病EPCs后，降低的AMPK活性得到提高，繼而MnSOD的蛋白水

15、平也有所回升。
　　 5.AMPK參與介導(dǎo)了miRNA let-7f對糖尿病EPCs功能的調(diào)節(jié)。首先，糖尿病小鼠EPCs中過表達(dá)let-7f可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)降低的AMPK活性，而抑制let-7f的表達(dá)則可顯著降低正常EPCs中AMPK的活性。let-7f對EPCs功能的改善作用可以被編碼功能負(fù)突變的AMPK的腺病毒載體(Ad-AMPK-DN)部分抑制。
　　 6.p66shc參與介導(dǎo)miRNA let-7f對EPCs功能的調(diào)

16、節(jié)。1型糖尿病小鼠EPCs中p66shc的蛋白水平升高，let-7f的過表達(dá)可抑制糖尿病小鼠EPCs中p66shc的蛋白表達(dá)。用Ad-p66shcRNAi轉(zhuǎn)染糖尿病EPCs后抑制其中p66shc的蛋白水平，可顯著改善糖尿病EPCs的功能障礙。Ad-p66shcRNAi轉(zhuǎn)染還可部分抑制由let-7f表達(dá)不足而導(dǎo)致的EPCs功能障礙。
　　 結(jié)論：
　　 1.MiRNA let-7f對改善1型糖尿病小鼠EPCs的功能有重要作