同源內(nèi)皮祖細胞對大鼠糖尿病潰瘍模型影響的實驗研究.pdf

1、隨著糖尿病發(fā)生率的不斷增高，糖尿病皮膚潰瘍也日益成為外科醫(yī)生共同關注的焦點之一。其中，潰瘍發(fā)生的部位以足部為多。國際糖尿病足病工作組(IWGDF)將糖尿病足病定義為糖尿病患者踝以下累及全層皮膚的創(chuàng)面，而與這種創(chuàng)面的病程無關。糖尿病是目前全世界第三大常見疾病(心臟血管病、腫瘤、糖尿病)，國外，糖尿病患者并發(fā)糖尿病足的機會高達15％，中山大學附屬第一醫(yī)院的一項臨床研究顯示，住院糖尿病患者并發(fā)糖尿病潰瘍的發(fā)生率達到了2.058％。糖尿病足也成

2、為皮膚慢性潰瘍的重要組成及代表。 糖尿病足給病人及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。據(jù)文獻報道，在美國，糖尿病性足部潰瘍每年費用達15億美元，在英國每年用于糖尿病足潰瘍的治療的費用達1.7億英鎊，這些費用僅包括換藥治療和社區(qū)醫(yī)護人員支出，而并不包括由此而來的病人生活質(zhì)量下降、經(jīng)濟受損等后果；在國內(nèi)，雖然沒有關于類似的統(tǒng)計資料，但隨著糖尿病足的發(fā)病率逐年上升，醫(yī)院及社會在此方面的支出也在逐年增長。 糖尿病足不僅增加了病人和社會的經(jīng)

3、濟負擔，而且，糖尿病潰瘍創(chuàng)面的存在，輕則增加病人痛苦，影響正常工作和生活；重則危及生命。大面積潰瘍創(chuàng)面的存在，可以影響機體的代謝、營養(yǎng)和免疫功能，甚至招來致命性的全身性感染。由于血液供應差，且多有神經(jīng)病變，糖尿病足潰瘍傷口愈合緩慢、臨床治療困難。出現(xiàn)壞疽機會較正常人群為高，往往需要進行截肢手術。而有些病人截肢后傷口仍不能愈合，不得不接受再次截肢手術。據(jù)統(tǒng)計，一側(cè)截肢的病人在第2年對側(cè)肢體截肢率高達30％，造成病人極大痛苦。因此促進潰瘍愈

4、合，盡快地封閉創(chuàng)面，是臨床治療中的重要課題。 隨著對創(chuàng)面愈合認識的深化，人們認識到，打破慢性創(chuàng)面的停滯狀態(tài)，使病理愈合模式向生理愈合模式轉(zhuǎn)變，是治療慢性創(chuàng)面的基本原則；治療工作及研究已從被動等待狀態(tài)轉(zhuǎn)向主動調(diào)控。 近年來，隨著對創(chuàng)面愈合過程的不斷深入，學者們紛紛認識到，打破慢性創(chuàng)面的停滯狀態(tài)，啟動創(chuàng)面的愈合的過程，需要針對創(chuàng)面不同的原發(fā)病，以及針對創(chuàng)面的不同時期，進行有針對性的治療。本世紀初，美國學者首先提出來“創(chuàng)面床準

5、備(Wound Bed Preparation，WBP)”理論，成為創(chuàng)面處理理論方面的里程碑。本課題組在既往的工作中，運用WBP理論，已做了大量有益的嘗試，取得了一定的成績。 本課題即是在此背景下，在以往的工作基礎上，對WBP理論指導創(chuàng)面治療進行有益的嘗試。 實驗目的： 本研究將在既往研究的基礎上進一步研究：1、在充分創(chuàng)面床準備條件下，體外誘導及培養(yǎng)大鼠外周血單個核細胞為內(nèi)皮祖細胞(Endophilial Pro

6、genitor Cell，EPC)，并將同源內(nèi)皮祖細胞移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面對愈合的影響。2、胰島素樣生長因子(Insulin—like Growth Factor-1，IGF-1)提純、擴增及鑒定，為進一步研究做前期準備。 實驗方法：本實驗共分二部分。 第一部分：同源內(nèi)皮祖細胞(EPC)移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面對愈合的影響。①大鼠外周血內(nèi)皮祖細胞的體外誘導及鑒定：用Ficoll—Paque離心法，分離Wister大鼠

7、外周血單個核細胞，將分離得到的細胞置于含10％FCS、VEGF 10 ng·L-1、bFGF 2 ng·L-1的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以Flk-1和vW因子的免疫熒光鑒定培養(yǎng)細胞；②糖尿病潰瘍大鼠動物模型的建立：3月齡雄性普通級Wistar大鼠10只，體重200～250 g。以四氧嘧啶法，復制糖尿病模型，并制造潰瘍創(chuàng)面，以模擬糖尿病慢性創(chuàng)面紅期階段進行實驗研究；③同源內(nèi)皮祖細胞移植于大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面，通過實驗研究了解效果。即：觀察創(chuàng)面

8、愈合時間；創(chuàng)面全愈當天處死大鼠，取原創(chuàng)面組織切片，行VEGF免疫組化染色，NIKON80i光學顯微鏡下照相，NIKON ACT-2u軟件攝入電子計算機；以Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對創(chuàng)面VEGF在照片視野中的面積、累積光密度進行分析，反映VEGF含量變化; PHILIPS CM10透射電鏡對創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)電鏡觀察。此步驟以5只正常大鼠皮膚組織做正常對照。第二部分：胰島素樣生長因子1(IGF-1)真核細胞表達質(zhì)

9、粒的構(gòu)建：Trizol自人肝臟組織提取cDNA，RNA，經(jīng)RT-PCR、PCR擴增，電泳鑒定目標DNA；大腸桿菌感受態(tài)細胞制備、酶切鑒定目標基因質(zhì)粒。 結(jié)果： 經(jīng)過研究，課題組達到了預期的研究目的：(1)成功地將大鼠外周血單個核細胞誘導分化為內(nèi)皮祖細胞，并利用免疫熒光的方法對其進行鑒定；(2)復制了穩(wěn)定的糖尿病潰瘍大鼠動物模型。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當劑量的四氧嘧啶(150mg／kg)可安全地復制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11

10、-14mmol／l對維持模型的存活是安全的；(3)局部移植EPC于模型，其愈合速度加快，組織中VEGF含量顯著增高，血管增生明顯；電鏡下血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)良好。證實EPC對創(chuàng)面愈合有促進作用。(4)成功構(gòu)建pMDl8-T-hIGF-1質(zhì)粒，為進一步研究IGF-1對慢性創(chuàng)面的愈合作用提供了實驗基礎。 結(jié)論①利用Ficoll-Paque離心法可以經(jīng)濟有效地自外周血單個核細胞中分離并誘導培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞；本實驗在體外誘導大鼠外周血單核細胞分化

11、為內(nèi)皮祖細胞，為移植自體大鼠內(nèi)皮祖細胞的研究打下了基礎。②適當劑量的四氧嘧啶(150mg／kg)單次腹腔內(nèi)給藥，可安全地復制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11-14mmol／l對維持模型的存活是安全的：③EPC局部移植可以促進糖尿病足慢性創(chuàng)面的愈合，其可能的原因是EPC移植，促進了VEGF分泌，增加了創(chuàng)面的微血管，改善了局部的微循環(huán)；④成功構(gòu)建pMD18-T-hIGF-1質(zhì)粒，為進一步研究pMD18-T-hIGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染、修飾EPC后