糖尿病大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：糖尿病是一種以高血糖為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，高血糖能誘發(fā)血管病變而致器官組織缺血。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管新生的前體細(xì)胞，可促進(jìn)血管新生和側(cè)枝循環(huán)的建立，為缺血性疾病的治療提供了新材料。但體內(nèi)獲取的EPCs數(shù)量不足及糖尿病本身對(duì)EPCs數(shù)量和功能的影響制約了EPCs在臨床的應(yīng)用。本研究力圖通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，探討糖尿病對(duì)EPCs的影響及EPCs在體外擴(kuò)增的適宜條

2、件，為EPCs的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分糖尿病大鼠模型制作
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)選用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型，探索一種安全、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好、動(dòng)物死亡率低的糖尿病模型建立方法。
　　 方法：健康Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為A、B兩組，每組20只。兩組給藥前均禁食不禁水12小時(shí)，A組為一次給藥法組，即按50mg/kg經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml）。B組采取兩次快速給藥法，

3、第1次給藥，按10mg/kg經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml），24小時(shí)后第2次給藥，按50mg/kg再次經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml）。72h后測(cè)空腹血糖值，以空腹血糖>16.7mmol/L作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：A組72小時(shí)內(nèi)死亡1只，72h測(cè)空腹血糖2只未成模，2周后死亡1只，死亡率10％，16只達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，成模率80％；B組72小時(shí)內(nèi)死亡1只，72h后測(cè)空腹血糖有1只未成

4、模，第5天死亡2只（其中1只為未成模大鼠），2周后死亡1只。死亡率20％，16只達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)期成模率80％（2個(gè)月）。
　　 小結(jié)：
　　 1.STZ單次給藥與兩次給藥比較，成模率及死亡率均無(wú)差別。
　　 2.應(yīng)用STZ制備糖尿病模型，是一種安全、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好、動(dòng)物死亡率低的方法。
　　 第二部分正常大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：在正常大鼠EPCs培養(yǎng)時(shí)加入不同濃度的重組人

5、粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）和重組人紅細(xì)胞生成素（rhEPO），通過(guò)監(jiān)測(cè)EPC數(shù)量及功能的變化，來(lái)探討rhG-CSF、rhEPO在EPCs體外擴(kuò)增中的作用，尋求促進(jìn)EPC體外擴(kuò)增的適宜條件。
　　 方法：健康Wistar大鼠10只，乙醚吸入麻醉下斷頸處死，取脛骨及股骨骨髓，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，NH4CL消化殘留紅細(xì)胞，加入含有20％胎牛血清、VEGF20ng/ml，bFGF10ng/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液中，

6、接種于鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，72小時(shí)后換液洗去末貼壁細(xì)胞，以后3天換液一次，細(xì)胞培養(yǎng)第7天，用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，爬片，免疫組化測(cè)定細(xì)胞表型（CD34、CD133、Flk-1）；同時(shí)以等數(shù)量細(xì)胞接種于96孔板，隨機(jī)分為分成對(duì)照組、rhG-CSF組和rhEPO組（CK組、G組和E組），rhG-CSF組根據(jù)濃度不同又分為（G1組、G2組、G3組、G4組），rhEPO組根據(jù)濃度不同又分為（E1組、E2組、E3組、E4組），分別加

7、入rhG-CSF和rhEPO的濃度為（8ug/L、40ug/L、200ug/L、1000ug/L）、（20IU/L、100IU/L、500IU/L、2500IU/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞數(shù)量和粘附功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.使用密度梯度離心法和NH4CL消化法獲得的骨髓單個(gè)核細(xì)胞含有具有內(nèi)皮分化潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
　　 2.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、重組人

8、促紅細(xì)胞生成素均對(duì)EPCs培養(yǎng)起到積極作用，1000ug/L的rhG-CSF與500IU幾的rhEPO兩組對(duì)活細(xì)胞數(shù)量、貼壁細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用最好。
　　 小結(jié)：
　　 1.內(nèi)皮祖細(xì)胞可以在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增，提示內(nèi)皮祖細(xì)胞可以通過(guò)體外擴(kuò)增的方法滿足臨床治療需要。
　　 2.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、重組人促紅細(xì)胞生成素可以通過(guò)劑量依賴的方式促進(jìn)體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，具有此方面潛在

9、的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 第三部分糖尿病大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：通過(guò)對(duì)比正常大鼠、糖尿病未控制血糖大鼠及糖尿病控制血糖大鼠三組骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的不同，探討糖尿病及高血糖對(duì)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響；通過(guò)研究促紅細(xì)胞生成素（EPO）對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量及功能變化的影響，探討EPO的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：Wistar大鼠30只，分為A、B、C三組，每組10只。A組為正常大鼠，B組為糖尿病未控

10、制血糖大鼠，C組為糖尿病控制血糖正常大鼠（胰島素治療）。細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟同第二部分，細(xì)胞培養(yǎng)第7天，0.25％胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，爬片做免疫組化（具體步驟同第二部分），三組細(xì)胞每組隨機(jī)分為不加藥組（加入等量的PBS液）和加藥組（加入500IU/L的rhEPO），以同等密度接種于96孔板，比較細(xì)胞數(shù)目與粘附功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，糖尿病大鼠控制血糖正常組與正常大鼠組無(wú)顯著性差異（p

11、>0.05），而兩者與糖尿病大鼠未控制血糖組相比均有顯著性差異（p<0.05），糖尿病大鼠組內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與功能下降。
　　 2.在體外培養(yǎng)體系中加入EPO，對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)均有積極作用。
　　 小結(jié)：
　　 1.糖尿病高血糖可影響內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的數(shù)量和功能，提示血糖控制對(duì)于在糖尿病個(gè)體中獲取做夠數(shù)量和功能的內(nèi)皮祖細(xì)胞至關(guān)重要。
　　 2.重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）能

12、夠?qū)φ４笫?、糖尿病大鼠?nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)起到積極作用，提示其有此方面的應(yīng)用價(jià)值。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用STZ成功地建立了糖尿病動(dòng)物模型。
　　 2.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、重組人促紅細(xì)胞生成素可以通過(guò)劑量依賴的方式促進(jìn)體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，而且重組人促紅細(xì)胞生成素也糖尿病大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)起到積極作用，提示具有此方面潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.糖尿病高血糖可影響內(nèi)皮祖細(xì)胞體外