小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖特征的研究.pdf

1、近年來的基礎(chǔ)和臨床研究提示內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialProgenitor cells，EPCs)可以治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血，也可以用于組織工程的血管構(gòu)建，或者作為基因治療的載體和腫瘤治療的新靶點(diǎn)等。由于內(nèi)皮祖細(xì)胞的諸多優(yōu)點(diǎn)及其廣泛的應(yīng)用前景，使得內(nèi)皮祖細(xì)胞成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。從而建立了一些分離、培養(yǎng)、鑒定的方法，并且對于內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖的特性也有了一些研究和了解。然而大部分的文獻(xiàn)是對外周血和臍帶血來源的內(nèi)

2、皮祖細(xì)胞的研究，對于骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)、增殖特性研究甚少。 研究目的：建立優(yōu)化的小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法、研究小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的集落形成能力和增殖潛能以及GM-CSF對小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用。 研究方法：用本實(shí)驗(yàn)室配制的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endo-M)培養(yǎng)小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，通過Wright’s Giemsa、免疫熒光法觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)及表型；MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)及不同濃度：Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細(xì)

3、胞集落生成的影響觀察：Endo-M對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響；通過內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞集落形成能力及增殖潛能；加入不同濃度的GM-CSF，通過集落形成率、MTT法和流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞生長周期等方法來觀察GM-CSF對小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 (Endo-M)誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞可以生成內(nèi)皮細(xì)胞，vWF檢測陽性。(2)MTT實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Endo-M組與對照組相比，P均小于0.05

4、，有顯著性差異。說明Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用明顯。內(nèi)皮細(xì)胞以較低濃度種植時可形成集落，Endo-M培養(yǎng)液對內(nèi)皮細(xì)胞集落的多少沒有影響，對內(nèi)皮細(xì)胞集落的大小影響顯著。(3)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有等級性，可分為四個等級：高增殖潛能內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(HPP-ECFCs)、低增殖潛能內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(LPP-ECFCs)、內(nèi)皮細(xì)胞叢(EndothelialCell C1uster)、成熟分化的內(nèi)皮細(xì)胞(Mature Diffe

5、rentiatedEdothelium)。HPP-ECFCs可以進(jìn)行再種植和第三次種植并形成集落。內(nèi)皮細(xì)胞整體的增殖能力顯示經(jīng)過 5 次傳代，內(nèi)皮細(xì)胞增殖了516.574±71.36倍。觀察小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞不同代次的增殖能力與不同代次集落增殖的比較，顯示隨著傳代的進(jìn)行，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖潛能和集落形成能力是逐漸下降的。(4)加入不同濃度的GM-CSF,通過觀察集落形成率和MTT法均證實(shí)了GM-CSF對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用。流式

6、細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示了GM-CSF處理組的細(xì)胞進(jìn)入S期的比率為9.3％，對照組為2.1％，說明GM-CSF可以通過促使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入S期，加快了細(xì)胞的分裂，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。比較第一代和第四次傳代后細(xì)胞的生長曲線，兩者無明顯差別，說明多次傳代后的內(nèi)皮細(xì)胞仍保持傳代早期內(nèi)皮細(xì)胞的增殖潛能。 結(jié)論：1．骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞具有等級性。 2．骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞有巨大的增殖潛能。 3．骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖潛能隨傳代次數(shù)的增加而逐