養(yǎng)心通脈方對(duì)兔骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響.pdf

1、研究背景:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（coronary atheroscleroticheart disease，CHD）冠脈彌漫性、多支病變無(wú)法通過(guò)PCI治療實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建，現(xiàn)有藥物無(wú)法改善這類心肌缺血。近年發(fā)現(xiàn)在成人外周血存在內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，EPCs可歸巢到缺血心肌局部，不僅參與缺血區(qū)血管新生，而且引發(fā)血管發(fā)生，通過(guò)移植EPCs可以很好治療缺血性疾病。如何加強(qiáng)EPCs的動(dòng)

2、員并增加其數(shù)量增強(qiáng)其功能是EPCs移植的關(guān)鍵。養(yǎng)心通脈方治療CHD效果顯著，推測(cè)養(yǎng)心通脈方能改善EPCs數(shù)量和功能。
　　目的:通過(guò)摸索養(yǎng)心通脈方改善體外培養(yǎng)的兔骨髓源EPCs線粒體活性干預(yù)作用的最佳藥物劑量和干預(yù)時(shí)間，并觀察養(yǎng)心通脈方在此干預(yù)條件下對(duì)EPCs的增殖、遷移和黏附功能的影響，為后續(xù)進(jìn)行移植養(yǎng)心通脈方預(yù)處理的EPCs促進(jìn)缺血心肌血管新生的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:利用密度梯度離心法，從骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞(

3、MNC)，并用內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)體系將MNC誘導(dǎo)培養(yǎng)為EPCs，對(duì)細(xì)胞DIL-AC-LDL和FITC-UEA-I熒光染色鑒定，并計(jì)算雙熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞率。利用CCK-8比色法觀察養(yǎng)心通脈方含藥血清對(duì)EPCs的線粒體活力的影響，并尋找養(yǎng)心通脈方含藥血清對(duì)EPCs的線粒體活力干預(yù)作用的最佳藥物劑量和干預(yù)時(shí)間。利用CCK-8法測(cè)定EPCs的增殖能力。首先建立CCK-8與EPCs反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將EPCs隨機(jī)分為治療組、對(duì)照組，各組經(jīng)預(yù)處理后酶

4、標(biāo)儀測(cè)450nm下OD值;利用Transwell遷移小室法測(cè)定EPCs遷移能力。治療組和對(duì)照組細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)后注入到Transwell小室上室，Transwell下室加培養(yǎng)液和VEGF(50ug/ml)。37℃、5％CO2溫箱培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，多聚甲醛固定濾膜下面的遷移細(xì)胞，吉姆薩染色后在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞;貼壁法觀察EPCs黏附能力。消化搜集各組細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)，細(xì)胞懸液接種到預(yù)先用FN包被的96孔

5、板，培養(yǎng)4h后倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野(×200)觀察貼壁細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:(1)EPCs的培養(yǎng)及鑒定:原代培養(yǎng)第2天細(xì)胞開(kāi)始貼壁，第3天形成集落，內(nèi)有多量單個(gè)核細(xì)胞，第4天梭形細(xì)胞從集落中心向外周長(zhǎng)出，第5天鏡形成類似胚胎時(shí)期的“血島”結(jié)構(gòu)，第10天鏡見(jiàn)集落內(nèi)梭形細(xì)胞放射狀排列，或者細(xì)胞首尾連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)到第20天的細(xì)胞呈DIL-ac-LDL和FITC-UEA-I雙熒光染色陽(yáng)性。(2)成功建立EPCs與CCK-8標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線。養(yǎng)心通脈方藥物濃度為10％時(shí)改善EPCs的線粒體活力作用最顯著(P＜0.05);養(yǎng)心通脈方藥物干預(yù)時(shí)間為96h時(shí)改善EPCs的線粒體活力作用最顯著(P＜0.05);養(yǎng)心通脈方在上述干預(yù)條件下能明顯增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移和黏附能力。
　　結(jié)論:一、本實(shí)驗(yàn)成功掌握了在體外培養(yǎng)骨髓來(lái)源的EPCs的關(guān)鍵技術(shù)，培養(yǎng)的EPCs穩(wěn)定性強(qiáng)，純度高，數(shù)量大且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)。二、養(yǎng)心通脈方能提高體外培養(yǎng)的兔骨髓源EPCs的活性，且這種