miRNA let-7f對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用.pdf

1、目的:近年來(lái)的研究表明，miRNA let-7在神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)增加，提示miRNA let-7家族可能參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)分化過(guò)程，但miRNA let-7f在NSCs分化中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將觀察miRNA let-7f在大鼠NSCs分化過(guò)程中的表達(dá)和調(diào)控作用。
　　方法:1、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescenetquantitative

2、PCR，qRT-PCR)技術(shù)對(duì)出生后1d、8d、14d SD大鼠腦組織中的miRNA let-7f進(jìn)行分析，蛋白印跡法(western blot,WB)檢測(cè)GFAP、Tuj1、nestin的變化;2、取胎鼠腦組織進(jìn)行NSCs體外分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，在分化后0d、3d、5d、7d分別觀察miRNA let-7f、 GFAP、Tuj1、nestin的變化;3、構(gòu)建大鼠miRNAlet-7f Inhibition及miRNA let-7f-

3、1慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染胎鼠NSCs，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為對(duì)照組、空載體組(EGFP)、下調(diào)組(miRNAlet-7f Inhibition)、上調(diào)組(miRNA let-7f-1)，轉(zhuǎn)染NSCs72h后觀察各組nestin的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染NSCs后誘導(dǎo)分化7d，觀察GFAP、Tuj1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1、隨著日齡的增加，SD大鼠腦組織nestin的表達(dá)逐漸減少，miRNA let-7f、 GFAP、Tuj1的表達(dá)逐漸增加;2、成功培

4、養(yǎng)出胎鼠NSCs，并在體外誘導(dǎo)分化，隨著NSCs分化天數(shù)的延長(zhǎng)， nestin的表達(dá)逐漸下降，miRNA let-7f、 GFAP、Tuj1的表達(dá)逐漸升高;3、在MOI=50，病毒滴度為1×108TU/mL，完全培養(yǎng)基條件下，慢病毒成功轉(zhuǎn)染NSCs，48h后開(kāi)始表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)，72h后熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，并在誘導(dǎo)分化后仍能穩(wěn)定表達(dá);4、慢病毒轉(zhuǎn)染72h后，下調(diào)基因組nestin表達(dá)量明顯高于其余三組，上調(diào)基因組nestin表

5、達(dá)最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs后誘導(dǎo)分化7d，上調(diào)基因組GFAP、Tuj1的表達(dá)明顯高于其余組，下調(diào)基因組GFAP、Tuj1的表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:miRNA let-7f與大鼠腦發(fā)育相關(guān)，下調(diào)miRNA let-7f的表達(dá)，促進(jìn)NSCs增殖，抑制NSCs分化，而上調(diào)miRNA let-7f的表達(dá)則抑制NSCs增殖，促進(jìn)NSCs分化，miRNA let-7f參與調(diào)控