microRNA在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)差異譜的研究.pdf

1、目的：觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠早期視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)改變，評(píng)價(jià)其作為早期糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值；測(cè)定DM大鼠視網(wǎng)膜VEGFmRNA和PEDF mRNA于不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，探討二者間的相互關(guān)系及其對(duì)于DR發(fā)生發(fā)展的相關(guān)意義，并從細(xì)胞因子角度進(jìn)一步評(píng)價(jià)STZ-DM大鼠作為早期DR動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值。以10w STZ-DM大鼠作為早期DR動(dòng)物模型，檢測(cè)視網(wǎng)膜microRNAs(miRNAs)的表達(dá)差

2、異譜，并初步探討其在DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。
　　 方法：64只體重180±20g雄性SD大鼠隨機(jī)分為CON組和DM組各32只，DM組按60mg/kg體質(zhì)量腹腔注射STZ1次建立DM大鼠模型；CON組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液作為對(duì)照。DM成膜后每周測(cè)量各組體質(zhì)量、血糖等一般生理指標(biāo)，并于2w、4w、6w、8w和10w各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽樣行視網(wǎng)膜實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)視網(wǎng)膜VEGFmRNA、PEDF mRNA的表達(dá)豐度

3、。10w時(shí)各組隨機(jī)抽樣對(duì)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行HE染色、FITC-Dextran灌注視網(wǎng)膜血管鋪片及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察；免疫組化染色檢測(cè)視網(wǎng)膜VEGF及PEDF的表達(dá)強(qiáng)度及部位；miRNA基因芯片篩選DM組與CON組視網(wǎng)膜表達(dá)顯著差異的miRNAs。qRT-PCR檢測(cè)目的miRNAs于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在視網(wǎng)膜中的表達(dá)豐度。并通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)表達(dá)差異顯著miRNAs的可能靶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.STZ腹腔注射DM成模率

4、100％。注射前DM組平均體質(zhì)量(187.5±5.4g)與CON組(185.0±6.9g)差異不顯著(P＞0.05)；STZ腹腔注射后，DM組體質(zhì)量增加不明顯，后期甚至有所減輕，CON組體質(zhì)量逐步增長(zhǎng)，10w時(shí)DM組平均體質(zhì)量(169.9±26.9g)與CON組(439.2±23.5g)差異顯著(P＜0.001)。注射前DM組平均血糖(6.49±0.68mmol/l)與CON組(6.60±0.59mmol/L)差異不顯著(P＞0.05)

5、；STZ腹腔注射72h后，DM組平均血糖(26.63±4.54mmol/l)與CON組(6.37±0.49mmol/l)差異顯著(P＜0.001)，～10wDM組血糖均＞16.7mmol/l，CON組保持在5.6～7.4mmol/l。視網(wǎng)膜HE染色顯示10w DM組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管擴(kuò)張，間質(zhì)水腫；CON組視網(wǎng)膜未見明顯異常。FITC-Dextran灌注視網(wǎng)膜顯示10w DM組血管迂曲，管徑不規(guī)則，未見毛細(xì)血管熒光滲漏、微血管瘤、視網(wǎng)膜

6、無(wú)灌注區(qū)等；CON組血管管徑均勻一致、分支自然流暢。透射電鏡下DM組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變主要有：毛細(xì)血管基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞指狀突起，線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；周細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；內(nèi)核層雙極細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變；感光細(xì)胞膜盤間隙增寬、數(shù)量減少；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體腫脹、嵴脫落、空泡樣變。
　　 2.經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，CON組視網(wǎng)膜有VEGF mRNA表達(dá)，表達(dá)量隨時(shí)間無(wú)明顯變化；DM組VEGF m

7、RNA的表達(dá)，2w時(shí)較CON組有所增高，至6w表達(dá)量約為CON組的3倍(P＜0.05)，10w表達(dá)量增高到CON組的6倍(P＜0.001)。PEDF mRNA也表達(dá)于CON組視網(wǎng)膜，DM組2w時(shí)的表達(dá)量較CON組有所減少，至4w其表達(dá)量約為CON組的1/2(P＜0.001)，10w表達(dá)量降至CON組的1/3(P＜0.001)。視網(wǎng)膜免疫組化染色觀察，CON組：VEGF主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層，PEDF主要分布于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層，其余各

8、層也可見陽(yáng)性表達(dá)；DM組VEGF表達(dá)較CON組明顯增強(qiáng)，視網(wǎng)膜各層神經(jīng)細(xì)胞均見有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；PEDF表達(dá)較CON組明顯減弱，其分布主要位于節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)叢狀層。
　　 3.miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示：和CON組比較，DM組共有168個(gè)miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化。其中，主要有miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-592、miR-190b、miR-502-3p、miR

9、-363、miR-29c*、miR-210等表達(dá)顯著上調(diào)；miR-10b、miR-10a、miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a、miR-451、miR-34a、miR-542-5p、miR-142-3p、miR-223、miR-18a等表達(dá)顯著下調(diào)。經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，大部分表達(dá)上調(diào)的miRNAs在視網(wǎng)膜中的表達(dá)量隨病程發(fā)展逐漸上升；表達(dá)下調(diào)的12個(gè)miRNAs的表達(dá)量隨病程發(fā)展均逐漸下降。生物信

10、息學(xué)分析結(jié)果顯示，這些表達(dá)顯著差異的miRNAs可以調(diào)控許多與DR密切相關(guān)基因的表達(dá)，如miR-29c*、miR-199a可能靶向VEGFa，miR-363可能靶向PEDF，等等。
　　 結(jié)論：
　　 1.STZ誘導(dǎo)的DM大鼠在病程10w時(shí)即已出現(xiàn)類似早期DR的相關(guān)改變，可作為人類早期背景型糖尿病視網(wǎng)膜病變(background diabetic retinopathy,BDR)的動(dòng)物模型以用于DR的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，并且該

11、造模方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、用時(shí)較短、重復(fù)性好、成功率高。
　　 2.作為主要血管生成刺激因子的VEGF和潛在血管生成抑制因子的PEDF，二者間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)調(diào)節(jié)血管滲漏與新生血管形成起著至關(guān)重要的作用。生理狀態(tài)下，VEGF在視網(wǎng)膜中呈低表達(dá)，而PEDF相對(duì)占有優(yōu)勢(shì)，這對(duì)維持視網(wǎng)膜血管完整、抑制新生血管形成是非常必要的。10w DM大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)增多、PEDF減少，破環(huán)了二者間的平衡關(guān)系，繼而可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜出現(xiàn)血管滲漏和新生血管等。

12、這就說(shuō)明VEGF與PEDF的失衡可能是造成DR發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，同時(shí)也從細(xì)胞因子角度進(jìn)一步證明了10w STZ-DM大鼠可作為早期BDR的動(dòng)物模型。
　　 3.早期BDR大鼠模型視網(wǎng)膜中，miRNAs的表達(dá)譜較正常對(duì)照有明顯差異；在這些表達(dá)明顯差異的miRNAs中，有些隨病程發(fā)展表達(dá)量逐漸上升，還有些隨病程發(fā)展逐漸下降；這些表達(dá)差異的miRNAs可能靶向許多與DR發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因。提示：miRNAs在DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程