Sonic Hedgehog促糖尿病小鼠傷口愈合及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景 糖尿病人傷口愈合功能受損在臨床上是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題，目前尚未有良好的治療辦法。傷口修復(fù)對(duì)人體來(lái)說(shuō)是一個(gè)有條不紊、循序漸進(jìn)的過(guò)程，它包括一系列相互交聯(lián)的階段，分別有：炎癥、細(xì)胞增生、基質(zhì)沉積和組織重建等。糖尿病人延遲的傷口愈合涉及到諸多因素，其中血管病變和神經(jīng)病變是主要因素。 Sonic hedgehog是一組密切相連的蛋白質(zhì)中的一員。它在胚胎發(fā)育中起到成形素的作用，也可誘導(dǎo)出生后的血管生成。 然而so

2、nic hedgehog是否參與了損傷的愈合過(guò)程，能否促進(jìn)糖尿病傷口的愈合以及sonic hedgehog參與損傷愈合的機(jī)制仍有待考證。最近的研究指出sonic hedgehog通過(guò)快速激活C-Fes／P13激酶通路和基因調(diào)節(jié)途徑來(lái)誘導(dǎo)毛細(xì)血管形態(tài)的形成。Sonic hedgehog在體外也可誘導(dǎo)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子Ⅰ和Ⅱ的表達(dá)。 很多證據(jù)表明一氧化氮在損傷愈合過(guò)程中起著重要的作用。人和動(dòng)物喂以富含精氨酸的食譜時(shí)，正常者和傷口愈合功能受

3、損的年老者，其愈合功能都得到改善。相反，NO缺乏直接導(dǎo)致?lián)p傷愈合功能受損。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)NOS的抑制可減少膠原沉積，加重切割傷的嚴(yán)重程度，并且使傷口的愈合功能受損。大鼠喂以無(wú)精氨酸的飼料時(shí)，損傷愈合功能就受到損害。因此，研究sonic hedgehog和N0在傷口愈合，特別是糖尿病延遲的傷口愈合中所起的作用，將為臨床治療糖尿病性皮膚潰瘍提供一條有效的途徑。 第一章Sonic hedgehog促進(jìn)1型糖尿病小鼠的傷口愈合目的本試驗(yàn)

4、將用正常小鼠和糖尿病小鼠兩種動(dòng)物模型探討：(1)在正常情況下，sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)傷口愈合的影響；(2)糖尿病時(shí)，抑制sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)傷口愈合的影響。 方法本實(shí)驗(yàn)分三部分： (1)1型糖尿病小鼠模型的建立：C57／B6雄性小鼠腹腔注射(i.P.)鏈佐霉。用Microvette采血管從小鼠后肢背部靜脈收集血樣，血糖濃度高于280mg／dl的小鼠定為糖尿病鼠。 (2)損傷模型的

5、建立：C57／B6成年雄性小鼠腹腔注射開(kāi)他敏和Xylazine，背部剃光毛發(fā)，剪一個(gè)深達(dá)肌膜的傷口，通過(guò)描繪出沙布上的傷口面積測(cè)量其閉合速率，用計(jì)算機(jī)程序算出傷口的面積。 (3)Sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)傷口愈合的影響：將sonichedgehog溶液或sonic hedgehog受體抑制劑cyclopamine溶液直接施用于傷口表面。通過(guò)描繪出沙布上的傷口面積來(lái)測(cè)量傷口的閉合速率。同時(shí)，按Western Blot分

6、析法測(cè)定Shh和Ptcl。 結(jié)果 (1)損傷后皮膚組織中的Shh和Ptcl蛋白質(zhì)含量明顯升高。三個(gè)劑量的sonic hedgehog(5、10、2 0μg／ml)溶液對(duì)正常小鼠的傷口愈合不起作用。然而，cyclopamine可以明顯地抑制正常小鼠的傷口愈合。(2)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，皮膚組織中內(nèi)源性的Shh和Ptcl蛋白質(zhì)含量明顯減少。(3)局部直接施用sonic hedgehog可加速糖尿病小鼠傷口的愈合，且呈濃度

7、依賴(lài)性關(guān)系；Cyclopamine可以明顯地抑制STZ糖尿病小鼠的傷口愈合。結(jié)論(1)損傷本身可誘導(dǎo)sonic hedgehog信號(hào)通路的激活；(2)Sonichedgehog信號(hào)通路在1型糖尿病鼠，其功能受到了損害，使用外源性的sonic hedgehog可加速傷口愈合。 第二章Sonic hedgehog促1型糖尿病小鼠傷口愈合的機(jī)制目的本實(shí)驗(yàn)將探討：(1)Sonic hedgehog與eNOS、NOS、NO的關(guān)系。(2)S

8、onic hedgehog促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制。 方法 本實(shí)驗(yàn)分兩大部分進(jìn)行： (1)動(dòng)物模型的建立及細(xì)胞培養(yǎng)：A．按第一章所述方法建立1型糖尿病小鼠模型和損傷模型；B.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)：取健康新生兒臍帶，灌入O.1％膠原酶II，收集臍帶內(nèi)的消化液。將消化液注入離心管，離心，棄上清液，用RPMll640培養(yǎng)液接種于6孔培養(yǎng)板。 (2)相關(guān)成分的分析測(cè)定用免疫印跡法測(cè)定eNOS和Ptcl；用放射免疫分析法測(cè)定N

9、OS的活性；測(cè)定亞硝酸鹽的濃度。 結(jié)果(1)Sonic hedgehog能明顯增加正常小鼠皮膚中eNOS蛋白的表達(dá)、NOS活性和NO含量，且呈濃度依賴(lài)性。它的這種效應(yīng)能被cyclopamine所阻斷。皮膚中NOS活性的增強(qiáng)及NO含量的增加效應(yīng)也可被L-NAME所逆轉(zhuǎn)。(2)Sonic hedgehog能增加STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠eNOS蛋白的表達(dá)、NOS活性及NO含量，且呈濃度依賴(lài)性。該效應(yīng)能被cyc lopamine所阻斷，L

10、-NAME也可抑制sonic hedgehog誘導(dǎo)的皮膚中NOS活性和NO含量的增加。(3)Sonic hedgehog可增加人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)eNOS蛋白的表達(dá)，NOS活性和NO含量，且也呈濃度依賴(lài)性。該效應(yīng)可被cyclopamine所阻斷，L-NAME也能抑制sonic hedgehog誘導(dǎo)的HUEVC中NOS和N0含量的增加。(4)LY294002能消除sonic hedgehog增加內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白的表達(dá)、NOS活