凍存活性微粒羊膜促糖尿病創(chuàng)面愈合的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病足部潰瘍是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在糖尿病病程中大約有25％的病人會發(fā)生下肢潰瘍。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案主要包括清創(chuàng)、創(chuàng)面敷料覆蓋保濕、創(chuàng)面感染控制、血管再造和減壓治療。但即使予以這些標(biāo)準(zhǔn)化治療，糖尿病創(chuàng)面仍然愈合緩慢，大約7％-20％的病人最終需要截肢?，F(xiàn)臨床急需新的治療手段加速糖尿病創(chuàng)面愈合，阻止足部潰瘍最終導(dǎo)致的截肢。
　　人羊膜來源于胎盤的最內(nèi)層，主要包括單層羊膜上皮細(xì)胞層、厚基底膜層以及無血管基質(zhì)層。早在20世紀(jì)初就有應(yīng)

2、用羊膜治療創(chuàng)面的臨床報道并取得了良好的效果。在過去的一百年中羊膜在創(chuàng)面愈合中的作用被許多文獻(xiàn)所證實(shí)，主要通過加速上皮化、減輕炎癥反應(yīng)、抑制瘢痕形成和抗菌等作用促進(jìn)創(chuàng)面愈合。近年來研究表明羊膜上皮細(xì)胞為多能干細(xì)胞，能向三個胚層細(xì)胞分化，且局部注射羊膜細(xì)胞浸提液及羊膜上皮細(xì)胞能加速急性創(chuàng)面的愈合。盡管此前眾多研究表明羊膜在創(chuàng)面修復(fù)中的巨大潛能，但仍然存在許多缺點(diǎn)限制了人羊膜臨床應(yīng)用潛能的最大化。首先，目前的保存方法（冷凍干燥法、伽馬射線滅菌

3、法以及甘油保存等）無法完整保存羊膜細(xì)胞活性，導(dǎo)致羊膜上皮細(xì)胞活性完全喪失或僅保存極低活性。其次，羊膜非常薄，機(jī)械強(qiáng)度低，目前臨床應(yīng)用大張羊膜覆蓋創(chuàng)面難以保證羊膜完全平整粘附到創(chuàng)面，羊膜很容易變干而與創(chuàng)面分離，僅能作為暫時的生物敷料短時間覆蓋創(chuàng)面。另外，羊膜上皮細(xì)胞在慢性創(chuàng)面中的治療作用及機(jī)制研究，以前未見報道。
　　目的：
　　在本課題中，我們臨床獲取胎盤廢棄新鮮羊膜并采用自制微粒皮切割機(jī)將其加工為300-600微米大小的微

4、?；蚰?。在應(yīng)用商品化的無血清干細(xì)胞凍存液凍存微粒羊膜半年后，我們復(fù)蘇羊膜并檢測其形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及生物活性因子，隨后移植復(fù)蘇后的微粒羊膜修復(fù)糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，評估其治療有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究所采用的凍存方法能良好保存羊膜的天然結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及生物活性因子。局部應(yīng)用凍存微粒羊膜能明顯促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，且移植后微粒羊膜中的羊膜上皮細(xì)胞能保持高移植潛能，在創(chuàng)面存活率高。隨后我們進(jìn)一步探究凍存活性微粒羊膜促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的

5、機(jī)制，主要通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探討凍存活性微粒羊膜對糖尿病創(chuàng)面炎癥的調(diào)控和新生血管化的影響，以及羊膜基質(zhì)能否作為真皮替代物長期存在于創(chuàng)面促進(jìn)真皮重構(gòu)。
　　方法：
　　1.采用自制微粒皮切割機(jī)將人新鮮羊膜制備為300-600微米大小微?；蚰ぃS后應(yīng)用無血清干細(xì)胞凍存液STEM-CELLBANKERTM凍存微粒羊膜半年，通過下面方法檢測凍存效果。
　　(1)H&E切片染色檢測復(fù)蘇后羊膜結(jié)構(gòu);
　　(2) live/

6、dead細(xì)胞活性試驗(yàn)檢測復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞活性;
　　(3)掃描電鏡觀察復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu);
　　(4)收集凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基，采用人生長因子抗體芯片、人趨化因子抗體芯片及人炎癥因子抗體芯片分別檢測活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基中生長因子、趨化因子及炎癥因子的表達(dá)情況。
　　2.將糖尿病小鼠分為三組:凍存活性微粒羊膜組、凍存去細(xì)胞微粒羊膜組和空白對照組。將凍存活性微粒羊膜移植于糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面并通過檢測

7、以下指標(biāo)評估其修復(fù)效果。
　　(1)定期拍照觀察創(chuàng)面愈合大體形態(tài)并計(jì)算不同時間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率;
　　(2)H&E染色觀察愈合創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)及羊膜在創(chuàng)面的降解情況;
　　(3)H&E染色及免疫組織化學(xué)染色抗人線粒體抗體觀察凍存活性微粒羊膜移植后羊膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)歸情況，TUNEL染色檢測人羊膜上皮細(xì)胞移植于創(chuàng)面后凋亡情況;
　　(4)免疫組織化學(xué)染色抗F4/80抗體觀察創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測創(chuàng)面M1型及M2型巨

8、噬細(xì)胞比例。ELISA檢測創(chuàng)面促炎因子及創(chuàng)面愈合相關(guān)因子的表達(dá)情況;
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測凍存活性微粒羊膜移植后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，免疫組織化學(xué)染色抗CD34和CD31抗體分別檢測創(chuàng)面造血祖細(xì)胞及新生血管數(shù)量。
　　3.收集凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基，通過以下方法評估其對原代鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞功能的影響。
　　(1) CCK-8法檢測凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對原代鼠

9、骨髓來源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞增殖能力的影響;
　　(2) Transwell小室測定凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對原代鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞遷移能力的影響;
　　(3)小管形成實(shí)驗(yàn)檢測凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成小管能力的影響;
　　(4) IFN-γ和TNF-α刺激原代鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞。通過顯微鏡觀察凍存活性

10、微粒羊膜條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞形態(tài)改變及PCR檢測M1型、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)水平的變化來評估凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對巨噬細(xì)胞極化的作用。
　　結(jié)果：
　　1.凍存復(fù)蘇后微粒羊膜和新鮮微粒羊膜中羊膜上皮細(xì)胞的活性分別為73.08％±2.95％和92.94％±2.27％。H&E染色結(jié)果顯示復(fù)蘇后單層羊膜上皮細(xì)胞緊貼于厚基底膜層，與新鮮微?；蚰そY(jié)構(gòu)類似。進(jìn)一步掃描電鏡結(jié)果顯示復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)保存完好，未見

11、膜孔洞形成。人生長因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)AR，EGFR，CSF2，CSF3，HB-EGF, HGF, IGFBP-2，IGFBP-3，CSF1R，NT-3，PDGFR和TGF-β1。人趨化因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)GRO，IL-8，MCP-1和MIP-1b。人炎癥因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)IL-6，IL-8，MCP-1，MIP-1b，TGF-β1，TNF-

12、β和TIMP-2。
　　2.1.凍存活性微粒羊膜移植后7天，創(chuàng)面濕而紅潤，微粒羊膜存活良好。創(chuàng)面第21天凍存活性微粒羊膜組大部分創(chuàng)面完全愈合，平均創(chuàng)面愈合率為94.64％±2.67％，明顯高于凍存去細(xì)胞微粒羊膜組（80.52％±3.85％，p＜0.001）和空白對照組（68.40％±5.37％，p＜0.001）。凍存活性微粒羊膜組及凍存去細(xì)胞微粒羊膜組中羊膜微粒充填于真皮基質(zhì)，真皮厚度明顯高于空白對照組，2個月左右大部分羊膜微粒發(fā)

13、生降解。
　　2.2.創(chuàng)面第5天，羊膜上皮細(xì)胞在創(chuàng)面存活良好，大部分緊密貼附于羊膜基質(zhì)并顯示出復(fù)層生長的趨勢，僅非常少量羊膜上皮細(xì)胞發(fā)生遷移。創(chuàng)面第7天少量羊膜上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，第28天時創(chuàng)面未檢測到人羊膜上皮細(xì)胞。
　　2.3創(chuàng)面第5天凍存活性微粒羊膜組創(chuàng)面F4/80陽性巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯高于其他兩組，但第10天時明顯低于其他兩組且M1型巨噬細(xì)胞比例顯著低于其他兩組、M2型巨噬細(xì)胞比例顯著高于其他兩組。創(chuàng)面第10天凍存活

14、性微粒羊膜組創(chuàng)面促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)顯著減少，而促創(chuàng)面愈合因子TGF-β1、IGF-1和VEGF表達(dá)顯著增高。
　　2.4創(chuàng)面第5天凍存活性微粒羊膜組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他兩組，且創(chuàng)面CD34陽性細(xì)胞數(shù)量也顯著增高。肉眼觀顯示創(chuàng)面第14天和21天凍存活性微粒羊膜組血管化明顯高于其他兩組，這一結(jié)果與免疫組化檢測創(chuàng)面新生血管數(shù)量結(jié)果一致。
　　3.IFN-γ+TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞伸出突起而凍存

15、活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞伸長向M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步PCR結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基能上調(diào)CD206基因表達(dá)而下調(diào)CCR7基因表達(dá)。凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移而對其增殖無影響。同時，凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞遷移、增殖及增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外成小管能力。
　　結(jié)論：
　　1、人新鮮羊膜以微?；问讲⒉捎脽o血清凍存液STEM-CEL