Sonic hedgehog改善1型糖尿病小鼠心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目前全世界糖尿病患者約1.5億，比10年前預測的糖尿病人數(shù)增加了5倍。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者不但心肌病發(fā)病率高，而且一旦出現(xiàn)心肌梗死，其癥狀更為嚴重，預后更差；如果梗死范圍相仿時，糖尿病患者的左心室功能更差，病死率更高。
　　糖尿病患者心肌損傷后修復能力顯著降低，導致這種修復障礙的原因很復雜，目前與之相關的分子機制主要有：糖尿病患者心肌梗死后，相比非糖尿病患者而言，其心肌組織硫氧還蛋白-1，血紅素加氧酶-1，低氧誘導因子-

2、1α，血管生長因子等表達水平下調(diào)，且細胞外信號調(diào)節(jié)激酶-5轉錄活性降低；而硝基酪氨酸，核轉錄因子kappa B，腫瘤壞死因子α和糖基化終末產(chǎn)物受體等表達水平上調(diào)，且泛素蛋白酶體活性增加。然而，對于糖尿病心肌梗死后心功能障礙加重的分子機制仍然不完全清楚。
　　脊椎動物的Hedgehog家族包括三個成員：Desert hedgehog，Indian hedgehog，Sonic hedgehog（Shh）。最早的Hedgehog基因是

3、在突變的果蠅上發(fā)現(xiàn)命名的。而Shh是被廣泛研究的Hedgehog同源基因，在胚胎發(fā)育時期參與機體內(nèi)許多器官、組織的發(fā)生和生長過程，包括神經(jīng)系統(tǒng)中線形成、眼睛發(fā)育、小腦細胞分裂、血管發(fā)生、心臟和冠脈形成；在成年時期也參與多種組織的修復，如中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、心血管系統(tǒng)等。
　　越來越多的證據(jù)表明Shh信號通路異常與心血管疾病密切相關。有研究表明，Shh信號通路在急性和慢性心肌梗死動物模型中被激活，而給予 Shh基因治療，可以顯

4、著改善這些動物的心功能障礙；而使用時空特異性基因靶點方法，使成年小鼠在體的心肌細胞和血管平滑肌細胞中HH信號通路失活（人為使smoothened受體被占用），則導致冠脈缺失、組織缺氧、心肌細胞凋亡、心力衰竭和死亡。
　　大量的研究已證實氧化應激是糖尿病并發(fā)癥，特別是心血管并發(fā)癥重要的病理生理機制。近年來有研究表明，Shh信號通路在糖尿病動物模型的神經(jīng)組織、陰莖海綿體、血管以及單核細胞中都是受損的。這種受損也已被證明與糖尿病神經(jīng)病變

5、、血管病變，糖尿病勃起障礙以及糖尿病單核細胞功能紊亂等糖尿病并發(fā)癥密切相關，我們之前的研究也證明糖尿病皮膚組織中 Shh信號通路是受損的，而給予Shh蛋白治療后，可以顯著改善糖尿病皮膚傷口的愈合。
　　因此，我們認為心肌組織Shh信號通路受損是糖尿病心臟功能障礙，特別是合并心肌梗死后心臟修復能力減弱，心功能障礙進一步加重的重要機制，而氧化應激是其通路受損的重要原因。本文采用1型糖尿病小鼠模型、1型糖尿病合并急性心肌梗死小鼠模型和原

6、代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞進行實驗。第一部分主要探討Sonic hedgehog在1型糖尿病小鼠心肌梗死過程中的變化情況及其治療效果；第二部分主要研究氧化應激是否導致糖尿病心肌組織Shh信號通路受損。通過這兩部分的研究，明確改善糖尿病心肌組織Hegehog信號通路對心肌梗死的治療效果，提出改善受損的心肌組織Hedgehog信號通路可能成為治療糖尿病合并心肌梗死的新的藥物靶點和治療思路。
　　第一部分：
　　Sonic hedg

7、ehog對1型糖尿病小鼠心肌梗死治療作用研究
　　目的：
　　探討Sonic hedgehog在1型糖尿病小鼠心肌梗死過程中的變化情況及其治療效果。
　　方法：
　　用1型糖尿病小鼠模型和1型糖尿病小鼠合并急性心肌梗死模型進行實驗。心肌梗死手術統(tǒng)一在糖尿病第7周進行。在小鼠心肌梗死手術后10min立即分別進行腹腔注射給予Shh信號通路受體激動劑SAG1.3（5mg/kg/d）和拮抗劑SANT（3.3mg/kg/d

8、），每天一次，并持續(xù)至實驗結束。用血糖和體重指標觀察糖尿病小鼠成模情況；用高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟收縮和舒張功能；Masson三色染色法檢測心肌纖維化情況；免疫組化方法檢測毛細血管密度；Western-blot方法檢測Shh信號通路中Shh，Ptc1和Gli1的蛋白表達水平。
　　結果：
　　與非糖尿病小鼠相比較，糖尿病小鼠表現(xiàn)為：
　　1.從第1周開始血糖就顯著升高，體重顯著降低，一直持續(xù)到第10周（實

9、驗結束）。
　　2.在第7周，糖尿病小鼠心肌組織中Shh、Ptc蛋白表達水平出現(xiàn)降低，第10周下降更顯著。Gli1蛋白表達水平在第10周也出現(xiàn)顯著降低。
　　3.在第10周的檢測結果表明糖尿病小鼠的心功能指標中E峰、EA比值、E峰衰減速率顯著降低，E峰衰減時間、等容舒張時間、射血時間顯著增加，而左室舒張內(nèi)徑、左室收縮內(nèi)徑、短軸縮短率、射血分數(shù)、每搏輸出量和每分輸出量都沒有顯著改變。
　　4.在糖尿病小鼠第7周實施心肌梗

10、死手術，術后1周時梗死周邊區(qū)心肌組織Shh、Ptc1、Gli1蛋白表達水平明顯減少。
　　5.在糖尿病小鼠第7周實施心肌梗死手術，術后3周時梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度顯著減少，心肌纖維化顯著增加，左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑顯著增加，短軸縮短率和射血分數(shù)顯著降低。
　　6.在糖尿病小鼠第7周實施心肌梗死手術，并在術后立即開始給予 Shh信號通路受體激動劑SAG1.3（5mg/kg/d），持續(xù)給藥1周，激動劑SAG1

11、.3顯著增加糖尿病小鼠心肌梗死組梗死周邊區(qū)心肌組織Ptc1和Gli1的蛋白表達水平；持續(xù)給藥3周，激動劑SAG1.3還顯著增加糖尿病梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度，并使心肌纖維化顯著下降，左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑顯著減少，短軸縮短率和射血分數(shù)顯著增加。激動劑SAG1.3對非糖尿病心肌梗死小鼠無明顯作用。
　　7.非糖尿病小鼠心肌梗死后持續(xù)給予SANT-1（3.3mg/kg/d）1周，梗死周邊區(qū)心肌組織Ptc1和Gli1的

12、蛋白表達水平顯著減少；持續(xù)給藥3周，拮抗劑SANT-1還能顯著降低梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度，并使心肌纖維化顯著增加，左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑顯著增加，短軸縮短率和射血分數(shù)顯著降低
　　小結：
　　1.1.型糖尿病小鼠心肌組織中Shh信號通路受損，并伴隨心臟舒張功能障礙。
　　2.1.型糖尿病小鼠心肌梗死后，心肌組織Shh信號通路激活障礙，并伴隨梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度進一步降低，心肌纖維化進一步增

13、加，心功能障礙進一步加重。
　　3. Shh信號通路受體激動劑能顯著增加1型糖尿病小鼠梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度，減輕心肌纖維化，并改善梗死后的心臟功能。
　　4. Shh信號通路受體拮抗劑則會導致非糖尿病小鼠梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度減少、心肌纖維化增加和心臟功能惡化。
　　第二部分：
　　氧化應激對1型糖尿病合并心肌梗死小鼠心肌組織Sonic hedgehog信號通路的影響
　　目的：
　

14、　探討氧化應激是否導致1型糖尿病小鼠及其合并心肌梗死后心肌組織Shh信號通路受損。
　　方法：
　　用1型糖尿病小鼠模型、1型糖尿病小鼠合并急性心肌梗死模型和原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞進行實驗。在糖尿病模型確立后，超氧化物岐化酶同系物Tempol（3mM）混同小鼠飲用水一起給予并持續(xù)到實驗結束。血糖和體重指標觀察糖尿病小鼠成模情況；超氧陰離子探針DHE檢測心肌組織中超氧陰離子水平；高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)檢測小鼠心臟收縮和

15、舒張功能；Masson三色染色法檢測心肌纖維化情況；免疫組化方法檢測毛細血管密度；Western-blot方法檢測Shh信號通路中Shh，Ptc1和Gli1的蛋白表達水平；超氧陰離子探針DCFH-DA檢測心肌細胞中氧活性物質水平。
　　結果：
　　1.在第7周和第10周，糖尿病小鼠心肌組織超氧陰離子水平顯著增加，而Tempol處理使增加的超氧陰離子水平得到顯著降低。
　　2.在第7周和第10周，Tempol處理還使降低

16、的糖尿病小鼠心肌組織Shh、Ptc1、Gli1蛋白表達水平顯著增加。
　　3.在第10周，14周和第18周，反映糖尿病小鼠心功能的指標E峰、EA比值、E峰衰減速率顯著降低，E峰衰減時間、等容舒張時間、射血時間顯著增加，表明糖尿病小鼠心臟功能出現(xiàn)障礙。Tempol處理18周，使得異常的糖尿病小鼠心臟功能指標E峰、EA比值、E峰衰減速率、等容舒張時間、射血時間均得到顯著改善。
　　4.糖尿病小鼠給予Tempol7周再實施心肌梗死

17、手術，術后1周時梗死周邊區(qū)心肌組織Shh、Ptc1、Gli1蛋白表達水平顯著增加；術后3周時還可以檢測到梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度顯著增加，心肌纖維化顯著降低，左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑顯著降低，短軸縮短率和射血分數(shù)顯著增加。
　　5.黃嘌呤氧化酶（1，1.5，2u/l）/黃嘌呤（0.5mM）氧化應激刺激系統(tǒng)作用乳鼠心肌細胞24小時后，使細胞內(nèi)Shh，Ptc1蛋白表達水平呈濃度依賴性降低。Tempol（0.1，0.5m

18、M）預先處理1小時后，可以顯著改善氧活性物質水平，并濃度依賴性的增加Shh，Ptc1的蛋白表達。
　　小結：
　　1. Tempol處理可以顯著改善1型糖尿病小鼠心肌組織Shh信號通路受損和心臟舒張功能障礙。
　　2.給予Tempol處理后再實施心肌梗死手術可以顯著改善1型糖尿病小鼠心肌梗死后梗死周邊區(qū)心肌組織 Shh信號通路的激活障礙，并使梗死周邊區(qū)心肌組織毛細血管密度的降低，心肌纖維化的增加和心功能障礙都得到部分恢

19、復。
　　3.預先給予 Tempol處理可以顯著改善乳鼠心肌細胞中黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤氧化應激系統(tǒng)導致的Shh信號通路降低。
　　全文結論：
　　1.心肌組織Shh信號通路受損導致糖尿病心肌梗死后心功能障礙加重。
　　2. Shh信號通路受體激動劑改善糖尿病心肌梗死后的心功能障礙。
　　3.氧化應激導致糖尿病及其心肌梗死后心肌組織Shh信號通路受損。
　　4.抗氧化劑治療改善糖尿病及其心肌梗死后心肌組