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文檔簡介
1、第一部分:目的:動脈粥樣硬化的發(fā)病涉及固有和獲得性免疫機制,近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞及其主要效應因子IL-17在多種經(jīng)典的慢性炎癥免疫性疾病中發(fā)揮致病作用。臨床研究表明急性冠脈綜合征患者體內(nèi)存在Th17/IL-17途徑即Th17細胞,IL-17及RORγt等表達上調(diào)。但Th17/IL-17途徑在動脈粥樣硬化中的具體作用尚不清楚,本實驗擬研究動脈粥樣硬化模型小鼠即ApoE-/-小鼠體內(nèi)是否存在Th17/IL-17途徑相關(guān)細胞及因子上調(diào)。
2、
方法:分別選取健康雄性的ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)8周齡,16周齡,24周齡,32周齡各12只,以性別、體重、周齡相匹配的C57BL/6J小鼠為陰性對照,分別檢測Th17各水平指標(包括主動脈旁淋巴Th17細胞比例,IL-17和IL-6細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子RORγt)在ApoE-/-小鼠與C57BL/6J對照小鼠中的表達。
結(jié)果:ApoE-/-小鼠Th17/CD4+細胞比例、相關(guān)細胞因子(IL-1
3、7和IL-6)及轉(zhuǎn)錄因子(RORγt)在四個時間點均較C57BL/6J對照小鼠上調(diào)。ApoE-/-小鼠的Th17細胞比例,相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子在8周時即表達增加,在8-16周(動脈粥樣硬化斑塊形成早中期)時達峰值,而后逐下降。
結(jié)論:動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)Th17/IL-17途徑相關(guān)因子上調(diào),提示Th17/IL-17途徑可能在動脈粥樣硬化中發(fā)揮作用。
第二部分:目的:前期實驗表明動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)有著更高水
4、平的Th17細胞,IL-17及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt,提示Th17細胞及其效應因子IL-17可能在動脈粥樣硬化中具有調(diào)節(jié)作用。本實驗通過抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)IL-17功能,觀察動脈粥樣硬化斑塊生物學標志的變化,從而探討IL-17在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用及可能機制。
方法:8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠每組10只,分別經(jīng)腹腔注射IL-17抗體和ratlgG2a同型,每周一次,共12周。計算各組小鼠斑塊面積;有免疫熒光
5、和Massion染色分別檢測斑塊中動脈粥樣硬化相關(guān)細胞(巨噬細胞,T淋巴細胞和平滑肌細胞)和膠原的含量;組織化學方法用于檢測VCAM-1和MMP-9蛋白在斑塊內(nèi)的表達。實時定量PCR方法檢測主動脈局部多種細胞因子(IFN-γ, IL-17,IL-6,TNF-α,VCAM-1,IL-4和IL-10)及MMP-9的mRNA表達;流式檢測主動脈旁淋巴結(jié)Th1,Th2,Treg及Th17細胞比例。
結(jié)果:IL-17抗體治療明顯減小
6、斑塊面積達47%,且顯著減少斑塊內(nèi)VCAM-1和MMP-9的蛋白表達,同時增加了斑塊內(nèi)平滑肌及膠原的含量,IL-17抗體治療亦明顯抑制主動脈內(nèi)IL-6,TNF-α,VCAM-1等炎癥因子及MMP-9的表達,抗體治療并未影響淋巴結(jié)內(nèi)Th1,Th2,Th17及Treg細胞的比例。
結(jié)論:抑制小鼠體內(nèi)IL-17能明顯減少斑塊面積,改善斑塊炎癥而增加纖維化,從而使斑塊趨于更穩(wěn)定的表型,IL-17具有促動脈粥樣硬化作用。
7、 第三部分:目的:我們發(fā)現(xiàn)Th17/IL-17途徑(Th17細胞、RORγt、IL-17和IL-6細胞因子)在ApoE-/-小鼠體內(nèi)上調(diào),隨后,我們抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)IL-17能明顯減輕動脈粥樣硬化并使斑塊斑塊中的SMCs顯著增加。在此,我們重點探討IL-17體外對血管平滑肌細胞(SMCs)的生物學作用,進一步闡明IL-17在動脈粥樣硬化中的作用機制。
方法:小鼠重組IL-17 (mrIL-17) 以不同的濃度(
8、0,50,100及200ng/ml)和時間點(12小時和24小時)體外單獨對小鼠SMCs進行刺激,用Annexin/PI雙染及流式的方法檢測細胞凋亡;mrIL-17以0,50,100及200ng/ml的濃度分別刺激SMCs 1小時,2小時,4小時和8小時,用實時定量方法檢測IL-17、IFN-γ、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、IL-6、MMP-2及MMP-9的mRNA表達。
結(jié)果:IL-17能以時間和劑量依賴的方
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