親環(huán)素A在大鼠動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性進(jìn)展性的炎癥疾病，是導(dǎo)致缺血性腦卒中的主要原因之一。一般認(rèn)為，AS以血管內(nèi)皮功能損傷為起始事件，隨著脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞形成，逐漸發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，最終引起血管閉塞事件發(fā)生。除內(nèi)皮損傷外，內(nèi)膜下的氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)得到越來(lái)越多的關(guān)注。氧化應(yīng)激是指機(jī)體受有害刺激時(shí)，氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，致使活性氧(reactiveoxygen species，ROS)在體內(nèi)大量蓄積導(dǎo)致組織和

2、細(xì)胞損傷的過(guò)程，是AS進(jìn)展的重要機(jī)制之一。
　　目前，親環(huán)素A(CyclophilinA，CyPA)與氧化應(yīng)激、動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系引起了諸多學(xué)者的關(guān)注。CyPA屬親免素蛋白家族成員，是重要的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子，在AS病變過(guò)程中，由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞分泌。有研究探討了血清CyPA濃度與急性冠脈綜合征(ACS)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ACS患者血清CyPA濃度明顯高于非冠脈綜合征患者血清水平，升高的CyPA濃度可能是ACS嚴(yán)重

3、程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。KLF2是一種轉(zhuǎn)錄因子，在大鼠血管中具有內(nèi)皮屏障功能，可通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS表達(dá)誘導(dǎo)血管舒張因子NO生成，維持血管內(nèi)皮完整及張力調(diào)節(jié)。我們前期的研究顯示:高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下刺激血管壁分泌CyPA水平升高，通過(guò)CyPA/KLF2/eNOS這一機(jī)制誘導(dǎo)血管舒張因子NO生成減少，導(dǎo)致血管內(nèi)皮舒張功能損傷，啟動(dòng)AS病變的發(fā)生。在課題的研究進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)，親環(huán)素A高表達(dá)不單破壞血管內(nèi)皮舒張功能，而且明顯誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥

4、反應(yīng)，管壁炎性細(xì)胞增生明顯，內(nèi)皮炎性反應(yīng)活躍，且隨著動(dòng)脈粥樣硬化病變程度加重，炎性細(xì)胞增生明顯、親環(huán)素A表達(dá)增加。由此推測(cè)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下CyPA可能通過(guò)某種機(jī)制介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展。
　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)是多種因素引發(fā)的一組胰島素分泌不足或胰島素抵抗為特征并伴有高血糖相關(guān)并發(fā)癥的代謝性疾病。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可通過(guò)葡萄糖自氧化、蛋白質(zhì)的非酶促糖基化、線粒體氧化磷酸化及抗氧化系統(tǒng)

5、清除能力減弱等機(jī)制導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)。糖尿病患者多數(shù)死于長(zhǎng)期高血糖引起的大血管、微血管及神經(jīng)損傷等血管并發(fā)癥，并且糖尿病患者腦動(dòng)脈粥樣硬化病變更為明顯，多發(fā)性腦動(dòng)脈狹窄發(fā)生率顯著增加，是影響糖尿病患者健康的主要危險(xiǎn)因素。但是CyPA是否參與糖尿病引起的動(dòng)脈硬化進(jìn)展，目前尚少見報(bào)道。本研究旨在探索CyPA對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化病變及糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變的作用及機(jī)制。
　　目的:
　　本研究旨在明確:
　　1

6、.親環(huán)素A在大鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的作用及其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制;
　　2.親環(huán)素A在糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化大鼠建模:40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組，動(dòng)脈粥樣硬化8周組（AS8W組），動(dòng)脈粥樣硬化12周組(AS12W組)，動(dòng)脈粥樣硬化16周組（AS16W組），每組10只。AS組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，并在高脂飼料喂養(yǎng)第二天給予一次性腹腔注射維

7、生素D3注射液60萬(wàn)IU/kg，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，腹腔注射等量生理鹽水。
　　2.糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型建立:糖尿病組（DM組）10只大鼠腹腔注射維生素D3注射液60萬(wàn)IU/kg，并給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食12小時(shí)，尾靜脈測(cè)空腹血糖，稱體重，按50mg/Kg一次性腹腔內(nèi)注射1％鏈脲佐菌素，注射后1小時(shí)給充足飲水及食物，空白對(duì)照組及AS組給予腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。造模2天后，進(jìn)行經(jīng)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(

8、IPGTT)，空腹血糖≥7.0mmol/L，腹腔注射葡萄糖后2h血糖≥11.1 mmol/L表明造模成功。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)至16周，8只大鼠造模成功。
　　3.體重及血糖監(jiān)測(cè):糖尿病造模2天后行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)，篩選糖尿病模型。每周監(jiān)測(cè)各組大鼠體重、測(cè)尾靜脈血糖變化。
　　4.各組大鼠血脂、血清胰島素及炎性因子水平檢測(cè):依據(jù)造模方式不同，采用ELISA技術(shù)分別檢測(cè)血膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、氧化性低

9、密度脂蛋白(ox-LDL)、血清胰島素、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)及血管細(xì)胞粘附因子-1(VCAM-1)的水平。
　　結(jié)果:
　　一、親環(huán)素A對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變作用及其可能機(jī)制
　　1.40只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束前無(wú)死亡，成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　2.各組大鼠體重、血脂及血清炎性因子測(cè)定
　　高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大

10、鼠毛色泛黃，飲食量減少。與對(duì)照組相比，動(dòng)脈硬化大鼠血膽固醇、甘油三酯及氧化性低密度脂蛋白含量均顯著增加（均P＜0.05，AS8W組、AS12W組、AS16W組比對(duì)照組）;且隨高脂飲食造模時(shí)間延長(zhǎng)，血脂逐漸升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，AS8W組、AS16W組比AS12W組）。各組大鼠血清炎性因子檢測(cè)結(jié)果顯示，動(dòng)脈硬化大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-a及VCAM-1等炎性因子較對(duì)照組大鼠明顯升高（均P＜0.05，AS8W

11、組、AS12W組、AS16W組比對(duì)照組）;動(dòng)脈粥樣硬化組間比較顯示，血清炎性因子在8W組、12W組、16W組中含量逐漸增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，AS8W組、AS16W組比AS12W組）。
　　3.動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著降低
　　檢測(cè)各組大鼠腹主動(dòng)脈血管環(huán)在乙酰膽堿濃度梯度下(1×10-9-1×10-4mol/L)舒張反應(yīng)。結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腹主動(dòng)脈血管環(huán)在乙酰膽堿濃度梯度下內(nèi)皮舒張功能良

12、好，最大舒張功能達(dá)（99.73±3.85）％。與對(duì)照組相比，高脂飲食的AS組大鼠血管環(huán)在乙酰膽堿濃度梯度下的內(nèi)皮舒張功能均明顯下降(P＜0.05，AS8W組、AS12W組、AS16W比對(duì)照組)。AS8W組、AS12W組及AS16W組間比較，結(jié)果提示在各濃度梯度下隨動(dòng)脈硬化造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張率逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，AS8W組比AS12W組;P＜0.05，AS16W組比AS12W組）;尤其在高脂喂

13、養(yǎng)第8周前后血管環(huán)內(nèi)皮舒張率下降速度明顯，第12周與16周后血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降相對(duì)平緩。
　　4.各組大鼠腹主動(dòng)脈HE染色結(jié)果及血管壁動(dòng)脈硬化斑塊面積及內(nèi)中膜厚度比較
　　空白對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮完整，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列整齊;動(dòng)脈硬化組大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮完整性損傷，可見內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞層增生、遷移，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彈性纖維斷裂，粥樣斑塊、鈣化斑形成。各組大鼠腹主動(dòng)脈HE染色顯示管壁斑塊病變逐漸加重。與對(duì)照組相比

14、，隨著高脂飲食造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)中膜厚度及斑塊橫斷面積與管腔面積百分比逐漸增加，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，AS8W組、AS12W組、AS16W比對(duì)照組;均P＜0.05，AS8W組、AS16W比AS12W組）。
　　5.大鼠腹主動(dòng)脈CyPA、p-ERK1/2及NF-kB蛋白表達(dá)水平比較
　　免疫組化染色結(jié)果顯示，各組大鼠腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)CyPA、p-ERK1/2表達(dá)存在明顯差異。與對(duì)照組相比，動(dòng)脈硬

15、化組大鼠管壁CyPA、p-ERK1/2表達(dá)顯著增加，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著遞增趨勢(shì)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，AS8W組、AS12W組、AS16W比對(duì)照組;P＜0.05，AS8W組、AS16W組比AS12W組）。Western-blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，血管壁親環(huán)素A、p-ERK1/2及NF-kB蛋白表達(dá)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著遞增趨勢(shì)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，AS8W組、AS16W組比AS12W組）。
　　

16、二、糖尿病通過(guò)促進(jìn)親環(huán)素A的表達(dá)加重大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變
　　1.糖尿病大鼠食量減少，消瘦，多飲多尿，精神差，共8只大鼠糖尿病造模成功。
　　2.糖尿病大鼠血清胰島素水平顯著減少而炎性因子水平升高
　　與對(duì)照組相比，單純高脂喂養(yǎng)的動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體重增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，而糖尿病大鼠多消瘦，體重下降明顯。對(duì)照組與動(dòng)脈硬化組大鼠血糖及血清胰島素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）;糖尿病大鼠血糖水平顯著升高，胰島素水平明顯下降

17、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，AS組、對(duì)照組比DM組）。與AS組相比，糖尿病進(jìn)一步增高動(dòng)脈粥樣硬化病變大鼠血中炎性因子水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，DM組比AS組）。
　　3.糖尿病加重大鼠腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變
　　空白對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮完整，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列整齊;AS組大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮完整性損傷，可見內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞層增生、遷移，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彈性纖維斷裂，粥樣斑塊形成。DM組大鼠腹主動(dòng)脈血

18、管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷脫落，整個(gè)血管壁可見明顯鈣化斑，彈性纖維斷裂，病變嚴(yán)重。
　　結(jié)論:
　　高脂飲食誘導(dǎo)大鼠血脂及血清炎性因子水平升高，機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激介導(dǎo)CyPA的高表達(dá)，可能通過(guò)CyPA-p-ERK1/2-NF-kB信號(hào)通路促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。糖尿病誘導(dǎo)CyPA、p-ERK1/2及炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中更為顯著表達(dá)，加重血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變。由此認(rèn)為糖尿病可能通過(guò)增加CyPA蛋白表達(dá)