Corin在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)及其作用的初步探討.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、心梗、中風(fēng)等眾多心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，控制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展是防治這些心腦血管疾病的根本性戰(zhàn)略性措施。盡管目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，且許多基因都與其病理過程有關(guān)，但作為一個(gè)多危險(xiǎn)因素綜合作用導(dǎo)致的疾病，其確切原因仍不十分清楚。因此進(jìn)一步探尋動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因及其在疾病中的作用，將有助于我們采取更加全面綜合和有效的方案來預(yù)防、治療與控制疾病。
　

2、　Corin是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，主要在心臟表達(dá)，通過活化心房利鈉肽（心鈉肽，atrial natriuretic peptide，ANP），調(diào)節(jié)血壓和心臟功能。Corin基因變異和功能障礙能導(dǎo)致其活性降低，可能與一系列心血管疾病如高血壓、心肌肥厚及心力衰竭等的發(fā)病相關(guān)。新近的研究表明，心肌細(xì)胞膜表面已處于活化狀態(tài)的corin可通過ADAM10酶切介導(dǎo)其脫落進(jìn)入血液循環(huán)中，且脫落釋放的可溶性corin片段是保留其活性的，所

3、以心臟表達(dá)的corin可能通過這種方式到達(dá)其它組織器官局部發(fā)揮作用。流行病學(xué)研究表明，人血漿中可溶性corin濃度與肥胖、中風(fēng)、心肌梗死疾病相關(guān)，提示corin可能參與了這些疾病的病理過程。但corin與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，還未見報(bào)道。
　　在本研究中，我們通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，首次對(duì)corin在主動(dòng)脈中的表達(dá)及其與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性進(jìn)行探討，并對(duì)其作用及機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　通過此研究，我們希望明確corin基因與動(dòng)脈粥

4、樣硬化病理過程之間的關(guān)系，進(jìn)一步擴(kuò)展我們對(duì)corin生物活性及作用特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，以及我們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步為動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的防治提供新的藥物作用靶點(diǎn)和思路。
　　目的:
　　1.檢測(cè)corin是否在主動(dòng)脈中表達(dá)，并確定其細(xì)胞表達(dá)定位。
　　2.明確corin與動(dòng)脈粥樣硬化損傷的相關(guān)性。
　　3.分別對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的corin和循環(huán)中由心肌細(xì)胞脫落而來的可溶性corin在動(dòng)脈粥樣硬化中的

5、作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法:
　　1.本研究采用RT-PCR、免疫組化和免疫熒光染色技術(shù)，首先確定corin是否在主動(dòng)脈中表達(dá)及其細(xì)胞定位。
　　2.體內(nèi)動(dòng)物模型建立與分組:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過給予ApoE-/-小鼠高脂飲食建立體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化模型，設(shè)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)組，正常飲食C57BL/6小鼠為對(duì)照組(WT)。然后采用RT-qPCR、Western blotting、免疫組化等技術(shù)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織和心肌組織

6、中corin及其底物ANP在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中的表達(dá)變化，從而明確corin與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。
　　3.體外模型建立與分組:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)株，首先通過RT-PCR和免疫組化、免疫熒光確認(rèn)corin在HUVECs中是否有表達(dá)，為以HUVECs作為體外模型奠定基礎(chǔ)。然后通過不同劑量ox-LDL刺激HUVECs，建立體外動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，采用RT-qPCR和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞中co

7、rin的表達(dá)水平變化。有助于進(jìn)一步明確corin與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。
　　4.siRNA轉(zhuǎn)染及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):體外通過小干擾RNA分別沉默內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)的corin，從而體外分別模擬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的corin缺失、以及由心臟脫落而來的可溶性corin的缺失，然后通過內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，分別觀察這兩部分corin的缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的影響。從而對(duì)這兩部分corin在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　

8、結(jié)果:
　　1.Corin在主動(dòng)脈局部有表達(dá)，且主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化模型組中，主動(dòng)脈局部表達(dá)的corin-ANP升高，提示主動(dòng)脈局部的corin可能通過活化ANP，參與動(dòng)脈粥樣硬化過程。而心臟中corin-ANP的表達(dá)與正常對(duì)照組相比，沒有顯著差異，但心臟表達(dá)的corin有多少能夠脫落進(jìn)入循環(huán)到達(dá)主動(dòng)脈局部發(fā)揮作用，我們尚未可知，因此對(duì)于心肌細(xì)胞合成后脫落生成的可溶性corin在

9、動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，我們又設(shè)計(jì)了進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，首先證實(shí)了corin在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞中corin表達(dá)升高，并呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。4.小干擾RNA沉默使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的corin缺失后，能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移;而使心臟脫落而來的可溶性corin缺失后，也能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。提示主動(dòng)脈局部內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的corin以及循環(huán)中由心肌細(xì)胞合成后脫落生成的