Th17細胞及效應(yīng)分子IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 動脈粥樣硬化是發(fā)生于大中動脈的慢性炎癥性病變，以大量脂質(zhì)沉積到血管壁為主要特點，并伴隨多種免疫細胞浸潤及平滑肌細胞增生，其所誘發(fā)的心腦血管疾病是發(fā)達國家及發(fā)展中國家常見的死亡原因之一。目前研究認為固有免疫應(yīng)答（巨噬細胞）和適應(yīng)性免疫應(yīng)答（CD4+T細胞）均參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，近年來對于CD4+T細胞在該疾病中的作用受到了廣泛的關(guān)注。CD4+T細胞分為多種亞群，主要包括Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細胞(regu

2、latoryTcells，Treg)以及近年來發(fā)現(xiàn)的Th17細胞。Th1細胞促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，Th2細胞在該疾病中的作用還不是非常明確，尚存在爭議。調(diào)節(jié)性T細胞在動脈粥樣硬化中主要發(fā)揮了保護性的作用，能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。然而，Th17在動脈粥樣硬化中的作用尚不明確。
　　 Th17細胞是以分泌IL-17A為主要特征的CD4+T細胞群體，CD4+初始T細胞受抗原刺激后，在轉(zhuǎn)錄因子RORγt和RORα的調(diào)控下，IL

3、-6和TGF-β聯(lián)合作用即可促使初始T細胞分化成為Th17細胞。目前的研究認為Th17細胞及IL-17A參與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生，例如:自身反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和結(jié)腸炎等，動脈粥樣硬化是發(fā)生在動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，前期有研究顯示急性冠狀動脈綜合癥患者外周血中Th17細胞的比例及IL-17A的水平較健康人明顯升高，而且在人的動脈粥樣硬化斑塊局部檢測到IL-17A的存在，這就提示Th17細胞

4、及IL-17A很有可能參與該疾病的發(fā)生和發(fā)展。但是，Th17細胞及其效應(yīng)分子IL-17A在動脈粥樣硬化模型小鼠的發(fā)生和發(fā)展中變化如何？對動脈粥樣硬化斑塊的形成究竟發(fā)揮什么樣的作用，尚存在爭議。IL-17A能否作為動脈粥樣硬化的治療靶點之一？IL-17A在該疾病中的作用機制是什么？目前這些問題尚不清楚，都非常值得研究和探索。
　　 為了明確Th17細胞及IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用，闡明其發(fā)揮作用的機制，為IL-17

5、A的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，本論文擬從以下兩部分進行研究:
　　 一、通過體內(nèi)外實驗確定Th17細胞及其主要效應(yīng)分子IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)展中的促進作用:
　　 （一）標(biāo)準(zhǔn)動脈粥樣硬化小鼠模型和快速頸動脈損傷小鼠模型的建立:通過高脂飲食喂養(yǎng)建立標(biāo)準(zhǔn)動脈粥樣硬化小鼠模型;高脂喂養(yǎng)聯(lián)合頸動脈縮窄手術(shù)模擬血管狹窄，建立快速頸動脈粥樣硬化小鼠模型，便于進行下一步研究。
　　 （二）Th17細胞及IL-17A

6、在動脈粥樣硬化斑塊局部及外周免疫器官的表達:通過多種方法檢測動脈粥樣硬化斑塊局部存在IL-17A及轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達以及Th17細胞的存在;流式細胞術(shù)檢測動脈粥樣硬化發(fā)生過程中，Th17細胞的比例及IL-17A在脾臟中呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，而且Th17細胞的比例與動脈粥樣硬化的發(fā)病程度以及血脂水平(TCH)具有明顯的正相關(guān)。
　　 （三）Th17細胞及IL-17A對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響:采用IL-17A中和性抗體或小鼠

7、重組IL-17A對小鼠進行體內(nèi)干預(yù)，從正反兩個方面證實IL-17A能夠促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，并且發(fā)現(xiàn)IL-17A能夠減少斑塊局部平滑肌細胞的含量，提示IL-17A還能夠促進斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展。
　　 二、從巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞凋亡入手探討IL-17A促進動脈粥樣硬化發(fā)展的分子機制
　　 （一）IL-17A對巨噬細胞凋亡的影響及作用機制:IL-17A在體外能夠促進巨噬細胞的凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在體外

8、能夠誘導(dǎo)小鼠及人來源的巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而且在體內(nèi)IL-17A也能夠誘導(dǎo)斑塊局部巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。體內(nèi)用化學(xué)伴侶PBA干預(yù)小鼠能夠緩解IL-17A誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，斑塊局部凋亡的巨噬細胞亦明顯減少，說明IL-17A能夠通過誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而促進巨噬細胞凋亡。
　　 （二）IL-17A加劇動脈粥樣硬化的發(fā)生機制:IL-17A單獨作用及IL-17A聯(lián)合PBA體內(nèi)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)IL-17A能夠通過促進斑塊局部巨

9、噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而導(dǎo)致巨噬細胞凋亡發(fā)揮加速動脈粥樣硬化斑塊形成的作用。
　　 （三）IL-17A誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制:IL-17A能夠上調(diào)巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)伴侶aP2的表達，而且IL-17A能夠激活巨噬細胞NF-κB和MAPK通路(ERK，p38和JNK)，進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-17A是通過激活NF-κB通路和p38、ERK通路上調(diào)aP2的表達。最后我們采用aP2抑制劑證實IL-17A是通過aP2的上調(diào)誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

10、應(yīng)激的發(fā)生。
　　 方法：
　　 一、通過體內(nèi)外實驗確定Th17和其主要效應(yīng)分子IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)展中的促進作用
　　 （一）標(biāo)準(zhǔn)動脈粥樣硬化小鼠模型和快速頸動脈損傷小鼠模型的建立:
　　 1.標(biāo)準(zhǔn)模型的建立:ApoE-/-雄性8周齡小鼠給予高脂飲食到小鼠16周和24周，同品系的C57BL/6野生型小鼠同時給予高脂喂養(yǎng)作為對照組。
　　 2.快速頸動脈損傷模型的建立:ApoE-/-雄性8

11、周齡小鼠給予高脂飲食兩周，即小鼠10周時行左側(cè)頸動脈縮窄手術(shù)模擬血管狹窄，小鼠繼續(xù)給予高脂飲食分別至16周和24周，同品系的C57BL/6野生型小鼠作為對照組。
　　 （二）Th17細胞及IL-17A在動脈粥樣硬化斑塊局部及外周免疫器官中的表達
　　 1.取小鼠主動脈根部和左側(cè)頸動脈制備連續(xù)冰凍切片，HE染色和油紅O染色檢測斑塊的形成和脂質(zhì)沉積情況;免疫組織化學(xué)染色檢測斑塊局部IL-17A和IFN-γ表達，并用免疫熒光雙

12、染的方法檢測IL-17A的細胞來源。
　　 2.取小鼠主動脈弓部抽提RNA，RT-PCR方法檢測IL-17A，RORγt和IFN-γ，T-bet在斑塊局部的表達。
　　 3.取小鼠脾臟制備脾細胞懸液，采用流式細胞術(shù)檢測Th1和Th17細胞的比例。
　　 4.分析Th1和Th17細胞比例與動脈粥樣硬化斑塊大小的相關(guān)性以及與小鼠血脂水平的相關(guān)性。
　　 （三）Th17細胞及IL-17A對動脈粥樣硬化斑塊形成的

13、影響
　　 1.中和性IL-17A抗體干預(yù)
　　 (1)ApoE-/-雄性8周齡小鼠20只給予高脂飲食兩周，小鼠10周行左側(cè)頸動脈縮窄手術(shù)，術(shù)后一周小鼠隨機分為兩組，實驗組小鼠腹腔注射小鼠中和性IL-17A抗體（50μg/只），對照組小鼠腹腔注射同型對照。
　　 (2)干預(yù)結(jié)束后一周微型超聲觀察斑塊形成情況，取小鼠左側(cè)頸動脈和主動脈根部制備連續(xù)冰凍切片，油紅O染色檢測斑塊大小。
　　 (3)免疫組化檢測斑

14、塊局部巨噬細胞和平滑肌細胞的表達。
　　 2.外源性小鼠IL-17A干預(yù)
　　 (1)ApoE-/-雄性8周齡小鼠10只隨機分為兩組給予高脂飲食，小鼠11周時，實驗組小鼠腹腔注射外源性小鼠重組IL-17A（2μg/只/次），對照組小鼠腹腔注射生理鹽水。
　　 (2)干預(yù)結(jié)束后一周，取小鼠主動脈根部制備連續(xù)冰凍切片，油紅O染色檢測斑塊大小。
　　 (3)免疫組化檢測斑塊局部巨噬細胞和平滑肌細胞的表達。

15、>　　 二、從巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞凋亡入手探討IL-17A促進動脈粥樣硬化發(fā)展的分子機制
　　 （一）IL-17A對巨噬細胞凋亡的影響及作用機制以及促進動脈粥樣硬化斑塊形成的機制
　　 1.體外實驗
　　 (1)取小鼠腹腔巨噬細胞，加入IL-17A刺激后，Hoechst染色從細胞形態(tài)學(xué)上觀察細胞凋亡，流式細胞術(shù)（AnnexinV/PI染色）檢測細胞凋亡的數(shù)量。
　　 (2)小鼠巨噬細胞系RAW264

16、.7及小鼠腹腔巨噬細胞，IL-17A刺激后收取細胞蛋白，WesternBlotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表達。
　　 (3)人單核細胞來源細胞系Thp-1和人外周血單個核細胞，體外誘導(dǎo)成巨噬細胞，IL-17A刺激后收取細胞蛋白，WesternBlotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表達。
　　 (4)小鼠腹腔巨噬細胞，加入IL-17A刺

17、激后，WesternBlotting檢測CHOP，caspase12和caspase3剪切體的表達。
　　 2.體內(nèi)試驗
　　 (1)ApoE-/-雄性8周齡小鼠30只給予高脂飲食，小鼠11周時隨機分為三組，實驗組其中一組給予腹腔注射小鼠重組IL-17A（2μg/只/次，每周一次），另外一組腹腔注射IL-17A（2μg/只/次，每周一次）和化學(xué)伴侶PBA（100mg/kg，每周兩次），對照組小鼠腹腔注射生理鹽水。

18、　　 (2)干預(yù)結(jié)束后一周，取小鼠主動脈根部制備連續(xù)冰凍切片，免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊局部Moma-2（巨噬細胞）、p-PERK和p-eIF2α的表達以及CHOP和caspase12的表達;Tunnel染色檢測斑塊局部巨噬細胞凋亡。取小鼠主動脈弓部抽提蛋白，WesternBlotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表達以及CHOP，caspase12和caspase3剪切體的表達。
　　 (3)

19、油紅O染色檢測斑塊大小。
　　 （二）IL-17A誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制
　　 1.小鼠腹腔巨噬細胞，IL-17A刺激后RT-PCR和WesternBlotting檢測aP2的表達。
　　 2.小鼠腹腔巨噬細胞在IL-17A作用前加入aP2抑制劑(BMS309403)刺激3小時，收取細胞蛋白，WesternBlotting檢測p-eIF2α和XBP1s的表達。
　　 3.小鼠腹腔巨噬細胞，IL-17

20、A刺激后WesternBlotting檢測p-IκB，p-ERK，p-p38和p-JNK的表達;IL-17A刺激前分別加入NF-κB(PDTC)，ERK(PD98059)，JNK(SP600125)和p38(SB203580)抑制劑作用1小時，然后用WesternBlotting方法檢測aP2的表達。
　　 結(jié)果：
　　 一、通過體內(nèi)外實驗證實Th17及效應(yīng)分子IL-17A能夠促進動脈粥樣硬化的發(fā)生
　　 （一）

21、Th17細胞及IL-17A在動脈粥樣硬化斑塊局部及外周免疫器官中的表達
　　 1.動脈粥樣硬化斑塊局部IL-17A和IFN-γ的表達
　　 為了研究Th17細胞和IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用，我們利用ApoE-/-雄性小鼠建立了快速頸動脈粥樣硬化模型和標(biāo)準(zhǔn)動脈粥樣硬化小鼠模型，取小鼠左側(cè)頸動脈和主動脈根部制備連續(xù)冰凍切片并進行HE染色和免疫組化染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠8周時，血管壁僅出現(xiàn)內(nèi)膜略微增厚沒

22、有明顯斑塊的形成，此時在斑塊局部幾乎檢測不到IL-17A和IFN-γ。高脂喂養(yǎng)到小鼠16周時，血管內(nèi)膜有明顯的增厚，平滑肌大量增生，形成較厚的纖維帽，大量有核細胞浸潤到斑塊局部，其斑塊結(jié)構(gòu)和組成屬于早期動脈粥樣硬化斑塊，此時斑塊局部能夠檢測到IL-17A和IFN-γ的表達，而對照組小鼠沒有明顯的斑塊形成也檢測不到IL-17A和IFN-γ的表達。小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)到24周時，斑塊大小較16周增加，纖維帽明顯變薄，斑塊表面僅有很薄的內(nèi)皮細胞覆

23、蓋，平滑肌細胞減少，斑塊內(nèi)呈現(xiàn)多個空泡樣的結(jié)構(gòu)即壞死核，此時的斑塊屬于動脈粥樣硬化晚期斑塊，同齡的野生型C57BL/6小鼠此時也沒有明顯的斑塊形成，免疫組化在斑塊局部僅能檢測到IL-17A，幾乎檢測不到IFN-γ的存在。
　　 此外，我們還采用RT-PCR檢測了主動脈弓部IL-17A和IFN-γ及轉(zhuǎn)錄因子RORγt和T-bet的表達，與免疫組化結(jié)果一致，在早期斑塊和晚期斑塊局部均能夠檢測到IL-17A的表達，且較對照組小鼠明顯升

24、高;但是IFN-γ僅在早期斑塊局部能夠檢測到而在晚期則幾乎檢測不到。RORγt和T-bet分別調(diào)控Th17和Th1細胞的分化，在ApoE-/-小鼠8周時表達即明顯高于對照組小鼠，而且其表達持續(xù)升高能夠維持到動脈粥樣硬化斑塊晚期。為了確定IL-17A的細胞來源，我們采用免疫熒光雙染的方法證實斑塊局部的IL-17A由CD4+T細胞和巨噬細胞分泌。上述結(jié)果提示Th17和Th1細胞均參與動脈粥樣硬化的發(fā)生，而且Th17細胞在動脈粥樣硬化晚期發(fā)揮

25、更重要的作用。
　　 2.Th17和Th1細胞隨動脈粥樣硬化的發(fā)生在外周免疫器官中的變化
　　 為了觀察Th17和Th1細胞在外周免疫器官中的變化，我們采用流式細胞術(shù)的方法檢測Th17(CD4+IL-17A+)細胞和Th1(CD4+IFN-γ+)細胞在脾臟中的比例，結(jié)果顯示在小鼠8周時，即無動脈粥樣硬化斑塊形成的小鼠脾臟中，實驗組和對照組Th17和Th1細胞無明顯的差異，在斑塊形成的早期，Th17和Th1細胞比例在Apo

26、E-/-小鼠脾臟中較對照組小鼠明顯升高;隨著疾病的進展，Th17和Th1細胞在斑塊形成的晚期進一步升高，此外在疾病晚期小鼠脾臟中還發(fā)現(xiàn)一群即能夠分泌IL-17A，同時也分泌IFN-γ的CD4+T細胞(CD4+IL-17A+IFN-γ+)較對照組小鼠也明顯升高。
　　 進一步統(tǒng)計學(xué)分析顯示Th17、Th1和CD4+IL-17A+IFN-γ+T細胞的變化與動脈粥樣硬化斑塊的大小均呈明顯的正相關(guān)，而且與小鼠血清中總膽固醇(TCH)的水

27、平也呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，這就提示Th17和Th1細胞均可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 （二）Th17細胞及IL-17A對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響
　　 為了證實Th17細胞及IL-17A在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用，我們用小鼠中和性IL-17A抗體和外源性小鼠IL-17A分別干預(yù)ApoE-/-小鼠，微型超聲和油紅O染色結(jié)果顯示抗IL-17A抗體能夠明顯抑制斑塊的形成，而外源性小鼠IL-17A則明顯促進動脈粥樣硬化斑塊的

28、形成，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示IL-17A干預(yù)組小鼠斑塊局部巨噬細胞的比例與對照組小鼠無明顯差異，而平滑肌細胞的比例較對照組小鼠明顯增多。該結(jié)果從正反兩個方面證實IL-17A能夠促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，而且有可能促進斑塊向不穩(wěn)定型斑塊發(fā)展。
　　 二、IL-17A通過激活NF-κB和p38，ERK通路上調(diào)aP2誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并繼發(fā)細胞凋亡進而加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展
　　 （一）IL-17A通過誘導(dǎo)巨噬細

29、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進細胞凋亡
　　 1.IL-17A促進巨噬細胞凋亡
　　 大量巨噬細胞凋亡能夠促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，為了研究IL-17A促進動脈粥樣硬化發(fā)生的機制，在體外巨噬細胞用IL-17A刺激后，Hoechst染色和AnnexinV/PI染色結(jié)果顯示，IL-17A刺激后，隨濃度的增高和時間延長，巨噬細胞內(nèi)凋亡小體明顯增多。流式細胞術(shù)定量分析顯示IL-17A能夠明顯促進巨噬細胞發(fā)生晚期凋亡。
　　 2.IL-

30、17A誘導(dǎo)小鼠及人來源的巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是動脈粥樣硬化發(fā)生過程中促進巨噬細胞凋亡的重要原因之一，為了研究IL-17A促進巨噬細胞凋亡的機制，小鼠巨噬細胞系RAW264.7和腹腔巨噬細胞在體外用IL-17A刺激后，WesternBlotting結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表達明顯升高，由此可見IL-17A能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了觀察IL-17A是否對人

31、來源巨噬細胞也具有同樣的作用，我們將單核細胞系Thp-1和人外周血單個核細胞(PBMC)體外誘導(dǎo)成巨噬細胞后，加入IL-17A刺激，WesternBlotting結(jié)果顯示p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表達同樣明顯升高。上述結(jié)果說明IL-17A在體外能夠誘導(dǎo)人和小鼠來源的巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 3.IL-17A誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊局部巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 為了驗證是否在小鼠體內(nèi)IL-17A也能誘

32、導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，我們首先用WesternBlotting檢測主動脈弓部p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表達，結(jié)果顯示IL-17A干預(yù)組小鼠斑塊局部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子的表達均明顯高于對照組小鼠。進一步我們采用免疫組織化學(xué)染色的方法定位檢測斑塊局部Moma-2，p-PERK和p-eIF2α的表達，結(jié)果顯示在巨噬細胞表達部位，p-PERK和p-eIF2α的表達量占斑塊面積的比例在IL-17A干預(yù)組小鼠明顯高于對照組小鼠，該

33、結(jié)果說明IL-17A不僅可以在體外，在斑塊局部也能夠誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 4.IL-17A通過誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進細胞凋亡
　　 長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠?qū)е录毎l(fā)生凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡主要通過上調(diào)CHOP的表達、激活caspas12分子、激活JNK進而活化Bcl-2，最終通過活化caspase3誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。為了探索IL-17A是否通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進巨噬細胞凋亡，我們首先在體外發(fā)現(xiàn)IL-1

34、7A能夠促進CHOP和caspase3剪切體的表達，caspase12略有上調(diào)。為了在小鼠體內(nèi)驗證該結(jié)果，我們將ApoE-/-小鼠隨機分為三組:對照組，IL-17A干預(yù)組，IL-17A聯(lián)合PBA干預(yù)組。WesternBlotting和免疫組化染色顯示IL-17A干預(yù)組小鼠斑塊局部CHOP表達明顯上調(diào)，而caspase12無明顯的差異，caspase3剪切體的表達亦明顯升高;而IL-17A聯(lián)合PBA干預(yù)組，p-PERK和p-eIF2α的表

35、達較IL-17A干預(yù)組明顯減弱，說明PBA能夠緩解IL-17A誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時CHOP和caspase3的表達較IL-17A干預(yù)組亦明顯減弱，caspase12無明顯的差異。Tunnel染色結(jié)果顯示IL-17A干預(yù)組小鼠斑塊局部凋亡的巨噬細胞數(shù)量明顯高于對照組小鼠，而IL-17A聯(lián)合PBA干預(yù)組凋亡細胞則較IL-17A干預(yù)組明顯減少。上述結(jié)果證實IL-17A通過誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而通過激活CHOP-caspase3通

36、路促進巨噬細胞的凋亡。
　　 （二）IL-17A通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的巨噬細胞凋亡促進動脈粥樣硬化的發(fā)生
　　 ApoE-/-小鼠隨機分為三組（對照組，IL-17A干預(yù)組，IL-17A聯(lián)合PBA干預(yù)組）進行干預(yù)后，我們采用油紅O染色的方法檢測斑塊的大小及脂質(zhì)沉積，結(jié)果顯示IL-17A干預(yù)組小鼠主動脈根部斑塊的面積明顯較對照組增大，而IL-17A聯(lián)合PBA干預(yù)組小鼠的斑塊面積則明顯較IL-17A單獨干預(yù)組減小，由此可見，IL

37、-17A確實是通過誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而通過激活CHOP-caspase3通路促進細胞凋亡、加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　 （三）IL-17A通過激活NF-κB和p38，ERK通路上調(diào)aP2誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生
　　 1.IL-17A上調(diào)aP2的表達誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　 有研究表明aP2表達增高能夠促進巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，為了研究IL-17A誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生機制，在體外我

38、們用RT-PCR和WesternBlotting檢測發(fā)現(xiàn)IL-17A能夠在RNA和蛋白水平上調(diào)巨噬細胞內(nèi)aP2的表達;此外在小鼠體內(nèi)我們也發(fā)現(xiàn)IL-17A干預(yù)組小鼠斑塊局部aP2的表達較對照組小鼠明顯升高。為了證實IL-17A是通過上調(diào)aP2的表達誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在體外我們先用aP2抑制劑作用于巨噬細胞，然后再加入IL-17A刺激，WesternBlotting檢測結(jié)果顯示p-eIF2α和XBP1s的表達較IL-17A單獨刺激明

39、顯減弱，該結(jié)果證實IL-17A通過上調(diào)aP2的表達誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。
　　 2.IL-17A激活NF-κB和p38、ERK通路上調(diào)aP2的表達
　　 IL-17A與其受體結(jié)合后能夠通過激活NF-KB和MAPK通路傳遞信號入細胞，誘導(dǎo)多種分子的表達。為了研究IL-17A上調(diào)aP2的機制，IL-17A刺激巨噬細胞后，我們采用WesternBlotting檢測發(fā)現(xiàn)p-IκB和p-p38，p-ERK，p-JNK的表達

40、均明顯升高。進一步我們分別用NF-κB和p38，ERK，JNK抑制劑作用巨噬細胞，然后用IL-17A刺激后檢測aP2的表達，結(jié)果顯示NF-κB和p38，ERK抑制作用后aP2的水平明顯減弱。由此可以證明IL-17A通過激活NF-κB和p38、ERK通路進而促進aP2的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.Th17細胞及效應(yīng)分子IL-17A具有促進動脈粥樣硬化的作用
　　 動脈粥樣斑塊局部Th17細胞和IL-17A高表達

41、，外周免疫器官中Th17細胞的數(shù)量隨著動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展逐漸升高，并與動脈粥樣硬化斑塊的大小及總膽固醇的水平呈正相關(guān)，體內(nèi)實驗證實Th17細胞及效應(yīng)分子IL-17A能夠促進動脈粥樣硬化斑塊形成。
　　 2.IL-17A誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和繼發(fā)的細胞凋亡是IL-17A加速動脈粥樣硬化斑塊形成的機制之一
　　 IL-17A在體外以及斑塊局部均能夠誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以進一步通過激活CHO

42、P-caspase3通路促進巨噬細胞凋亡，進而加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　 3.IL-17A誘導(dǎo)的aP2上調(diào)是其導(dǎo)致巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制之一
　　 IL-17A可通過激活NF-κB和p38、ERK通路上調(diào)脂肪酸結(jié)合蛋白aP2的表達，抑制劑阻斷aP2的表達則明顯抑制IL-17A誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 本研究通過體內(nèi)外實驗，系統(tǒng)研究了新的T細胞亞群Th17細胞及其主

43、要效應(yīng)分子IL-17A在動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用及其機制，對揭示動脈粥樣硬化的免疫機制、防治動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病具有重要的理論價值和潛在的應(yīng)用價值。本研究的主要創(chuàng)新點和意義如下:
　　 1.證明Th17和IL-17A參與促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，外源性IL-17A治療明顯促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，而中和性抗IL-17A抗體的應(yīng)用可有效緩解斑塊的發(fā)展，為臨床以IL-17A為靶點治療動脈粥樣硬化提供了有力的理論和實

44、驗依據(jù)。
　　 2.在國內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)IL-17A能誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼發(fā)的細胞凋亡是IL-17A促進動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制之一，用化學(xué)伴侶分子PBA阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效控制IL-17A介導(dǎo)的動脈粥樣硬化病變的進展。
　　 3.在國內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)IL-17A可通過NF-κB和p38/ERKMAKP信號通路上調(diào)脂肪酸結(jié)合蛋白aP2，進而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生;首次通過aP2將細胞因子和脂質(zhì)代謝聯(lián)系在一

45、起，為研究炎癥反應(yīng)與脂質(zhì)代謝疾病的相互關(guān)系及機制提供了新的思路。
　　 4.本研究證實IL-17A中和性抗體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA能夠抑制斑塊的形成，aP2抑制劑能夠緩解巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，為臨床以炎性因子、細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及脂質(zhì)代謝為靶點聯(lián)合治療動脈粥樣硬化提供了有力的理論和實驗依據(jù)。
　　 研究的局限性
　　 1.IL-17A誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的機制還有待于更深入的研究;
　　 2.aP2影響IL-1