Th9-IL-9在實驗性動脈粥樣硬化進程中的作用及意義.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病和外周血管性疾病的主要病理學基礎，在西方發(fā)達國家是重要致死因素，近年來隨著生活水平的提高，也逐漸成為我國中老年人群的主要死亡原因之一。目前 AS的發(fā)病機制尚未完全闡明，大量臨床和基礎研究表明，AS是一種慢性炎癥性疾病，包括CD4+T淋巴細胞在內(nèi)的多種免疫細胞和細胞因子參與其中。Th9細胞是一種新發(fā)現(xiàn)的 CD4+T淋巴細胞亞群，初始CD4+T細胞受到抗原刺激后在轉(zhuǎn)化生

2、長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）的作用下可分化為 Th9細胞并分泌大量的 IL-9，其產(chǎn)生和功能受轉(zhuǎn)錄因子 PU.1調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)Th9細胞參與調(diào)節(jié)哮喘和炎癥性腸病等多種炎癥性疾病的發(fā)生，但當前Th9細胞在AS進程中作用研究甚少。Thl7細胞也是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T淋巴細胞亞型，具有很強的促炎作用，與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展有

3、關。研究證實 Th17細胞發(fā)揮促AS作用。泡沫細胞是AS形成的重要病理學基礎，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可促進泡沫細胞形成，與AS的發(fā)生密切相關。本研究通過復制AS模型，分析Th9/IL-9的表達變化及其與Th17/IL-17、ox-LDL的相關性，并通過體內(nèi)干預實驗與細胞實驗進一步明確Th9/IL-9在AS進程中的作用，并初步探討其機制，為防治AS提供新的靶點。<

4、br>　　目的：探討CD4+IL-9+T細胞（Th9）和IL-9在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中表達變化及意義，并初步探討其機制。
　　方法：（1）高脂喂養(yǎng)復制ApoE-/-小鼠AS模型，通過檢測各種指標分析Th9/IL-9在實驗性動脈粥樣硬化進程中的作用和意義。①48只雄性8周齡 ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，同周齡C57BL/6對照小鼠普通飼料喂養(yǎng)，分別飼養(yǎng)0周（0w）、4w、12w和24w后處死；②分別留取不同周齡小

5、鼠血清檢測血脂的變化：③取不同周齡小鼠的主動脈制備石蠟切片，HE染色觀察小鼠主動脈斑塊形成情況；④流式細胞術檢測不同周齡小鼠脾臟 Th9細胞和Th17細胞表達率的變化；⑤酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）法檢測不同周齡小鼠血清IL-9、 IL-17和 ox-LDL濃度變化；⑥逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain r

6、ecation，RT-PCR)法檢測不同周齡小鼠的脾臟和主動脈斑塊中PU.1和RORγt mRNA表達水平變化。（2）通過ApoE-/-小鼠體內(nèi)干預實驗，分析重組 IL-9（rIL-9）蛋白和 IL-9單克隆抗體（IL-9mAb）對 AS發(fā)生發(fā)展的影響。①ApoE-/-小鼠15只，隨機分為3組，分別是PBS對照組、rIL-9干預組和IL-9mAb干預組，從8周齡開始尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)12周；②HE染色檢測主動脈斑塊大小，ELIS

7、A法檢測血清IL-9濃度。（3）泡沫細胞誘導實驗探討Th9/IL-9在AS進程中的作用機制。①收集C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞并貼壁培養(yǎng)；②將腹腔巨噬細胞分為3組，分別是對照組、ox-LDL誘導組和rIL-9干預組，培養(yǎng)3天后進行油紅染色，觀察泡沫細胞形成情況。
　　結果：（1）血脂檢測顯示隨著飼養(yǎng)時間延長，ApoE-/-小鼠總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平呈升

8、高趨勢，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平不斷降低，同周齡 C57BL/6小鼠血脂水平無顯著變化。ApoE-/-小鼠高脂飼養(yǎng)4w時，主動脈僅出現(xiàn)增厚，12w時，主動脈出現(xiàn)斑塊，24w時，斑塊面積顯著增大，與12w相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而同周齡C57BL/6小鼠在整個飼養(yǎng)過程中主動脈并無明顯增厚或者斑塊形成。（2）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠Th9細胞和Th17細胞表達率均

9、高于同周齡C57BL/6小鼠（P<0.01），且隨著飼養(yǎng)周齡的延長，Th9細胞和Th17細胞表達率均明顯升高。24w時，Th9細胞表達率顯著高于12w（P<0.01），而Th17細胞表達率雖然增高，但與12w比較無明顯差異。（3）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠血清 IL-9、IL-17和ox-LDL濃度均高于同周齡C57BL/6小鼠，且隨著飼養(yǎng)周齡的延長，IL-9、IL-17和ox-LDL濃度不斷增加。24w時，IL-9濃度達最高，

10、而IL-17濃度在12w時達到最高。（4）ApoE-/-小鼠血清IL-9濃度和脾臟Th9細胞表達率與血清ox-LDL、IL-17濃度及脾臟Th17表達率均呈顯著正相關（均P<0.01）。（5）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠脾臟和主動脈組織中 PU.1和 RORγt的表達水平均高于同周齡C57BL/6小鼠（均P<0.01），隨著飼養(yǎng)周齡的延長，PU.1和RORγt的表達水平不斷升高。（6） ApoE-/-小鼠在進行 rIL-9干預后，

11、其主動脈斑塊面積、血清 IL-9濃度與PBS對照組相比均顯著增大，而在進行IL-9mAb干預后，其主動脈斑塊面積、血清IL-9濃度與PBS對照組相比明顯減小。（7）rIL-9干預組誘導生成的泡沫細胞較ox-LDL誘導組明顯增多。
　　結論：（1）隨著飼養(yǎng)周齡的延長，ApoE-/-小鼠動脈斑塊形成和發(fā)展，同時Th9/IL-9和Th17/IL-17表達亦明顯升高；Th9/IL-9在AS斑塊形成的整個進程均呈顯著增高趨勢，而Th17/I