Th17-IL-17及其單克隆抗體在大鼠小腸移植免疫調控中的作用研究.pdf

1、器官移植是臟器功能衰竭終末期的有效、常規(guī)性治療手段。隨著器官移植技術的不斷發(fā)展，許多器官的移植已經(jīng)成為現(xiàn)實。常用于移植的器官包括角膜、心臟、肺、胰腺、肝臟、小腸、腎臟、骨髓等。而在我國，異基因器官移植在所有移植病例中占了絕大多數(shù)。其在給家庭和個人帶來希望的同時也面臨著重大的問題，即移植后嚴重的急性和慢性排斥反應，它是導致受體死亡的主要原因。
　　小腸移植是腸衰竭患者最為理想的臨床標準治療方法。雖然小腸移植的臨床嘗試與開展已有半個世

2、紀，但是其效果與肝臟、腎臟和心臟移植相比仍有很大差距。究其原因，主要是因為小腸富含淋巴組織和大量的組織相容性抗原，患者在小腸移植術后會產生強烈的宿主抗移植物反應、移植物抗宿主反應和嚴重的全身感染。因此，對小腸移植術后產生免疫排斥反應機制的深入研究及相應對策的實施將是改善小腸移植預后的關鍵。
　　目前小腸移植排斥反應的機制尚不完全清楚。在小腸移植排斥反應的發(fā)生發(fā)展過程中，多種免疫細胞和細胞因子參與了其中。而T細胞的分化增殖所介導的C

3、TL和B細胞以及調節(jié)性T細胞在小腸移植術后免疫排斥的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。此外，參與免疫應答的細胞因子在該過程中也發(fā)揮了極其重要的作用。IL-2和IFN-γ是Th1細胞分泌的主要細胞因子，具有廣泛的免疫調控和免疫增強作用，可促進T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞的活化，以加重移植排斥反應。TNF、IL-6、IL-8在加重排斥反應過程中也具有類似的作用。而IL-4通過抑制IL-1、IL-6和TNF的分泌，抑制T、B細胞的活化而抑制移植排斥

4、反應。TGF-β、IL-10和內皮素ET則可以下調移植術后的免疫排斥反應。
　　Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個CD4+T淋巴細胞的亞群，其不同于Th1、Th2細胞亞群，主要表達IL-17。IL-17是一種作用很強的促炎因子，誘導促炎細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8的表達，引起細胞浸潤和組織破壞。其主要的靶細胞為上皮細胞，內皮細胞及成纖維細胞等。研究表明，其在自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤和移植免疫等疾病中發(fā)揮了重要作

5、用。IL-17通過與IL-17R結合發(fā)揮生物學效應，而這些靶細胞在小腸組織中含量尤為豐富。由IL-17介導的炎癥反應在小腸組織中更為嚴重。因此，我們設想其生物學功能可能與小腸移植排斥反應的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系。
　　FK506是一種新型高效的免疫抑制劑，較CsA有更強的免疫抑制作用，使小腸作為單一移植物已成為可能，在移植患者中得到了廣泛應用。FK506通過抑制移植排斥相關細胞因子(IL-2等)的產生進而抑制T細胞活化，以抑制移植

6、后免疫排斥反應。此外，F(xiàn)K506還可以抑制排斥反應早期淋巴細胞在移植部位的聚集以及其它炎癥細胞的趨化。FK506對免疫排斥的抑制作用是否也有Th17/IL-17的參與目前仍不清楚。FK506雖然在臨床小腸移植術后廣泛應用，但因其使用劑量大，嚴重的腎毒性和神經(jīng)毒性等毒副作用仍不容忽視。因此，深入研究小腸移植免疫排斥的分子機理并開發(fā)新的抗排斥藥物勢在必行。
　　鑒于Th17/IL-17在免疫反應中的重要作用，本課題采用大鼠同種異體小腸

7、移植模型和人小腸移植活檢標本研究Th17/IL-17是否參與了小腸移植術后的免疫排斥反應，研究Th17/IL-17在FK506抗排斥反應中可能的作用，探索性地觀察IL-17單克隆抗體在小腸移植術后免疫排斥中的保護作用，為小腸移植術后排斥反應的發(fā)生機制的研究提供了依據(jù)，為IL-17單克隆抗體的臨床應用奠定了實驗基礎。主要結論如下：
　　1、證明了人活體小腸移植術后移植腸Th17/IL-17的表達與急性排斥反應正相關。
　　為了

8、探索在人小腸移植術后移植腸Th17/IL-17與排斥反應之間的關系，我們收集、整理了我科1999年-2003年間的4例活體血緣性小腸移植患者圍手術期移植腸活檢標本及相關資料，用激光共聚焦顯微鏡檢測了移植腸浸潤CD4+IL-17+Th17細胞的表達情況，證明了小腸移植患者術后移植腸Th17/IL-17的表達與急性排斥反應的相關性。提示，Th17/IL-17表達水平的升高可能在患者小腸移植術后強烈的免疫排斥反應過程中發(fā)揮了重要作用。IL-1

9、7可能成為小腸移植急性排斥反應早期重要的預警指標和特異、敏感的診斷指標之一。
　　2、構建了穩(wěn)定可靠的同種異體小腸移植動物模型。
　　為了通過動物實驗進一步驗證上述假設，本課題采用一種自制、可調控的旋轉持續(xù)靜脈輸液裝置，與節(jié)段性異位小腸移植術相結合，構建了近交系大鼠F344→LEW的同種異體小腸移植模型。結果顯示，該輸液裝置能成功地為實驗大鼠連續(xù)輸液1月以上，改善受體的血供和營養(yǎng)，顯著提高移植成功率(95.0％)，為小腸移植

10、免疫的研究提供了良好的實驗基礎。
　　3、小腸移植大鼠的移植腸內Th17/IL-17表達也與急性排斥反應正相關。
　　為了驗證在大鼠小腸移植術后移植腸內Th17/IL-17表達是否也與急性排斥反應正相關。我們利用實時定量PCR、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡和ELISA等方法檢測了移植腸及血清Th17/IL-17的表達，同時檢測了移植物中相關細胞因子和轉錄因子的表達。結果顯示，IL-17mRNA在正常小腸組織中低表

11、達。在異基因移植未治療組大鼠急性排斥反應期IL-17和RORγtmRNA表達持續(xù)升高。細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和IFN-γmRNA在移植后第3，5，7天的表達也呈上升趨勢。相反，IL-4、TGF-β和Foxp3mRNA在異基因移植未治療組術后低表達，3，5，7天呈逐漸下降趨勢。
　　4、Th17/IL-17可能參與了FK506對移植排斥的抑制作用。
　　為了探討FK506對移植排斥的抑制作用是否有可

12、能通過Th17/IL-17發(fā)揮作用，在大鼠小腸移植術后給予FK506抗排斥治療，然后用上述方法檢測了相關細胞和因子的表達。結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506治療能明顯降低IL-17的表達，減少移植腸內Th17細胞的表達，抑制移植腸急性排斥反應的發(fā)生，移植物中TGF-βmRNA和Foxp3mRNA的表達升高。說明Th17/IL-17參與了FK506對移植排斥的抑制過程。
　　5、制備了IL-17單克隆抗體，應用IL-17單克隆抗體治療可以在一定程

13、度上抑制小腸移植術后急性排斥反應，延長移植物的存活時間。
　　為了探索IL-17單克隆抗體在抑制移植排斥中的作用，本研究利用雜交瘤克隆，制備抗大鼠IL-17mAb，并用于大鼠小腸移植術后的早期治療。我們發(fā)現(xiàn)，IL-17mAb治療組大鼠術后移植腸IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8mRNA表達降低，而IL-4和TGF-βmRNA表達緩慢升高。結果顯示，與異基因移植未治療組相比，IL-17mAb治療能明顯延長大鼠存活

14、時間，術后移植腸組織病理學檢查無排斥反應依據(jù)。說明，IL-17mAb治療可以有效抑制大鼠小腸移植術后的急性排斥反應，明顯改善移植物的生存。
　　6、結論
　　通過本課題的研究，發(fā)現(xiàn)人小腸移植術后移植腸內有Th17/IL-17的表達，且其表達程度與術后急性排斥反應正相關。為了探索Th17/IL-17是否參與了小腸移植術后的免疫排斥反應，本研究通過構建同種異體大鼠小腸移植模型，進一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸移植術后移植腸內也存在Th1

15、7/IL-17的表達，其表達與移植物免疫排斥程度呈正相關。同時發(fā)現(xiàn)移植腸RORγt、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和IFN-γmRNA在移植后第3，5，7天的表達升高，而IL-4、TGF-β和Foxp3mRNA在異基因移植未治療組術后低表達，3，5，7天呈逐漸下降趨勢。
　　FK506治療能明顯降低IL-17的表達，抑制移植腸急性排斥反應的發(fā)生，升高移植物中TGF-βmRNA和Foxp3mRNA的表達。說明Th17/I

16、L-17參與了FK506對移植排斥反應的抑制過程；移植術后早期應用IL-17mAb可以抑制移植腸急性排斥反應的發(fā)生。
　　以上結果說明，Th17/IL-17參與了小腸移植術后急性排斥反應的發(fā)生，且許多細胞因子也參與其中，F(xiàn)K506可能通過下調小腸移植后移植腸內和血清Th17/IL-17的表達而抑制急性排斥反應的發(fā)生。IL-17mAb的早期應用證實了其在抑制移植排斥反應中的有效性，為臨床小腸移植急性排斥反應的防治和誘導免疫耐受提供了