PCFs-PAR2-MMP-12在RSV感染后慢性氣道炎癥和AHR中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是引起毛細(xì)支氣管炎最常見病毒病原，嚴(yán)重RSV感染后可導(dǎo)致慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness,AHR)與反復(fù)喘息，甚至與后期哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RSV感染后期神經(jīng)源性因素同時(shí)參與調(diào)控慢性氣道炎癥和AHR。肺C類神經(jīng)纖維(Pulmonary C fibers,PCFs)是支配呼吸道主要的傳入感

2、覺神經(jīng)，在環(huán)境刺激物或者內(nèi)源性介質(zhì)刺激時(shí)激活，致支氣管收縮和粘液分泌增加等副交感神經(jīng)反應(yīng)，促進(jìn)氣道炎癥和AHR形成。RSV感染能夠激活肺C類神經(jīng)纖維，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究擬探討RSV感染后激活的PCFs在RSV感染后氣道炎癥和AHR中的作用及機(jī)制。
　　方法：BALB/c新生小鼠于生后第2天給予辣椒素50mg/kg，皮下注射，建立去除肺C類神經(jīng)纖維小鼠模型（KPCF小鼠），未去除肺C類神經(jīng)纖維小鼠給予辣椒素對(duì)照液（10％無水乙

3、醇，10% Tween80,0.9%生理鹽水混合液）（野生型小鼠）；待小鼠生長(zhǎng)至6-8w時(shí)，給予RSV100μl含1.8×107 PFU病毒液和HEP-2細(xì)胞培養(yǎng)上清，滴鼻，建立KPCF小鼠RSV感染模型和KPCF小鼠對(duì)照組，即：KPCF-RSV組和KPCF-Control組。野生型小鼠同時(shí)給予RSV病毒液和HEP-2培養(yǎng)上清，即：RSV組和Control組。每日監(jiān)測(cè)小鼠體重；于感染后第5天和第21天處理小鼠收集標(biāo)本，進(jìn)行以下檢測(cè)：空斑

4、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度；BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類及肺組織病理H&E染色評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)；雙腔體描計(jì)法檢測(cè)小鼠氣道阻力sRaw值，評(píng)估AHR；提取各組小鼠肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Q-PCR檢測(cè)T-bet基因表達(dá)；ELISA檢測(cè)BALF中IFN-γ和SP的水平，組織免疫熒光染色檢測(cè)肺組織NK1R表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)IFN-γ介導(dǎo)的氣道炎癥和AHR需要PCFs的參與，我們給予KPCF小鼠和野生型小鼠重組IFN-γ細(xì)胞因子（rI

5、FN-γ），BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和雙腔體描計(jì)法分別評(píng)估氣道炎癥和AHR。
　　結(jié)果：RSV感染后兩種小鼠的體重均下降，KPCF-RSV組小鼠體重下降較RSV組小鼠減少，體重恢復(fù)時(shí)間短；RSV感染后第3、4、5天，肺組織勻漿RSV病毒滴度KPCF-RSV組小鼠較RSV組小鼠降低；RSV感染后第5天，KPCF-RSV組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞較RSV小鼠減少；雙腔體描計(jì)法檢測(cè)結(jié)果顯示KPCF-RSV組小鼠吸入乙酰甲膽堿后sRaw值

6、較RSV組小鼠降低；Q-PCR結(jié)果顯示RSV感染后肺組織T-bet表達(dá)升高，而KPCF-RSV組小鼠肺組織T-bet基因表達(dá)與RSV小鼠相比，無明顯差異；進(jìn)而ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示RSV感染后BALF中IFN-γ水平顯著升高，而KPCF-RSV組小鼠BALF中IFN-γ水平與RSV小鼠相比，無顯著差異。進(jìn)一步給予rIFN-γ因子后，小鼠分為Control、rIFN-γ、KPCF-Control及KPCF-rIFN-γ組，rIFN-γ組小

7、鼠出現(xiàn)氣道炎癥和AHR，而KPCF-rIFN-γ小鼠未出現(xiàn)氣道炎癥和AHR，提示IFN-γ介導(dǎo)的氣道炎癥和AHR可能需要PCFs參與。RSV感染后第21天，KPCF-RSV小鼠較RSV小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少，以巨噬細(xì)胞降低為主；肺組織病理H&E染色顯示：KPCF-RSV小鼠較RSV小鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；BALF中SP水平KPCF-RSV小鼠較RSV小鼠降低；組織免疫熒光染色肺組織NK1R結(jié)果顯示，KPC