初次RSV感染時間影響成年期再次RSV感染時天然輔助細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥.pdf

1、目的：
　　天然輔助細(xì)胞(natural helper cells，NHCs)在2010年腸道黏膜發(fā)現(xiàn)，屬于Ⅱ型固有免疫淋巴細(xì)胞的一種，其具有強(qiáng)大的Th2型細(xì)胞因子分泌能力，在病毒感染所誘發(fā)的氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus RSV)是秋冬季節(jié)引發(fā)嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎及肺炎常見致病菌，且兩年內(nèi)90％以上的嬰幼兒感染過RSV。因RSV感染后無法建立較長久的免疫記憶和免疫保護(hù)，

2、故RSV反復(fù)感染的情況臨床極為常見。有研究發(fā)現(xiàn)初次RSV感染發(fā)生在新生期的BALB/c鼠，成年期再次RSV感染時氣道炎性反應(yīng)明顯重于初次感染發(fā)生在成年期的模型鼠，提示初次感染時間差異可能影響再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥。眾多免疫細(xì)胞和免疫分子參與RSV感染誘發(fā)的哮喘，其中固有免疫細(xì)胞最為突出，如近年來發(fā)現(xiàn)的天然輔助細(xì)胞在RSV感染誘發(fā)或加重哮喘中的作用而受到關(guān)注。前期研究表明RSV感染可增加肺組織內(nèi)NH細(xì)胞數(shù)量，提高NH細(xì)胞分泌Th2型細(xì)

3、胞因子活性，證實NH細(xì)胞是參與RSV誘發(fā)哮喘的重要免疫細(xì)胞。但在新生期初次RSV感染，成年期再次感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重的氣道炎癥中，是否有NH細(xì)胞的參與，其作用機(jī)制如何，目前尚不清楚。故在本研究中，通過建立新生期初次RSV感染，成年期再次感染的實驗動物模型，利用HE染色觀察肺組織病理、ELISA檢測BALF中細(xì)胞因子蛋白含量、Real-timeRT-PCR測肺組織及NH細(xì)胞的Th1/Th2型細(xì)胞因子mRNA、流式細(xì)胞術(shù)檢測NH細(xì)胞的數(shù)量及免疫

4、磁珠分選等實驗方法，探究NH細(xì)胞在初次感染RSV時間差異所導(dǎo)致的再次感染時肺局部炎癥程度不同中的作用及其可能的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期相比，新生期初次RSV感染誘發(fā)肺組織及局部炎性細(xì)胞浸潤;肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量增多，Th2型細(xì)胞因子蛋白含量增加;肺組織局部內(nèi)Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平亦增高，證實對比成年期初次感染RSV，新生期初次RSV感染，成年期再次感染導(dǎo)致氣道炎性癥狀加重。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)新生期初

5、次RSV感染，其肺組織局部內(nèi)NH細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時IL-5+-NH細(xì)胞、IL-13+-NH細(xì)胞數(shù)量亦明顯多于成年期初次RSV感染組，提示新生期初次RSV感染可能通過影響肺NH細(xì)胞數(shù)量及分泌Th2型細(xì)胞因子活性，左右再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥。過繼回輸NH細(xì)胞，誘導(dǎo)新生期初次RSV感染誘導(dǎo)模型鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量增加，其中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多更為明顯，同時肺組織內(nèi)Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平因回輸NH細(xì)胞而顯著升高，進(jìn)一步證

6、實NH細(xì)胞通過分泌Th2型細(xì)胞因子，介導(dǎo)新生期初次RSV感染，成年期再次RSV感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　1、主要試劑
　　PBS、Diff-Quick染液、HE染液、PAS染液、膠原酶D(Sigma)、DNsaeⅠ(Sigma)、水合氯醛、胎牛血清(TBD)、胰酶、青霉素、鏈霉素、紅細(xì)胞裂解液、小鼠淋巴細(xì)胞分離液(TBD)、4％多聚甲醛、ELISA試劑盒(R&D)、Real-t

7、ime RT-PCR試劑盒(Takara)、RNA提取試劑盒(Takara)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)、磁珠抗體(Miltenyi)、流式抗體FITC anti-lin mAb、APC anti-CD45mAb及PE anti-IFN-γ/IL-5/IL-13 mAb(BioLegend)，流式抗體Percp anti-ST2 mAb(eBioscience)。
　　2、病毒
　　人類呼吸道合胞病毒A2型(RSV A2)

8、，Hep-2細(xì)胞增殖病毒，30％蔗糖超速離心法分離病毒粒子，-80℃冰箱保存。病毒滴度用組織細(xì)胞半數(shù)感染量(50％tissue culture infections dose，TCID50)表示。
　　二、實驗材料
　　1、感染模型
　　購買于北京華阜康生物有限公司的成年BALB/c雌雄鼠隨機(jī)交配繁殖，產(chǎn)生的新生鼠，隨機(jī)分為三組，即:新生期1周齡初次RSV感染+成年期8周齡再次感染組(Neonate2°)、成年期4周齡

9、初次感染+成年期8周齡再次感染組(Adult2°)和正常PBS對照組(Mock)。感染途徑為經(jīng)鼻粘膜感染RSV。新生1周齡鼠初次感染劑量為1×105 TCID50 RSV，成年4周齡鼠初次感染劑量為2×105 TCID50.二組8周齡再次感染時的劑量均為2×105 TCID50;正常對照組用PBS替代RSV滴鼻，再次感染后第2天收集相關(guān)實驗標(biāo)本。
　　2、病理分析
　　用1m1 PBS經(jīng)支氣管沖洗肺組織，收集肺泡灌洗液(Br

10、onchoalveolar lavagefluids，BALF)。離心后收集上清，-20保存?zhèn)溆?。?00μl PBS懸浮細(xì)胞沉淀，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)并制備細(xì)胞涂片。Diff-quick染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野，計數(shù)200個細(xì)胞，分別計數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量及其百分比。取模型鼠左下肺，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及肺炎癥反應(yīng)。
　　3、細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)
　　利用TRI

11、zol試劑盒提取肺組織總RNA及NH細(xì)胞的RNA，SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用real-time RT-PCR技術(shù)檢測模型鼠肺組織及肺提取的NH細(xì)胞的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)水平。
　　4、肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的含量
　　按照ELISA試劑盒說明，定量測定肺胞灌洗液中Th1與Th2型細(xì)胞因子的含量，簡述如下:酶標(biāo)板包被特異性抗體后4度過夜。1％牛

12、血清白蛋白封閉后加入肺泡灌洗液標(biāo)本，室溫孵育2小時后，加入酶標(biāo)二抗，底物顯色，450nm波長讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算肺泡灌洗液中Th1與Th2型細(xì)胞因子的含量。
　　5、肺淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液的提取
　　腹腔注射水合氯醛深度麻醉小鼠，20ml冷凍PBS經(jīng)心臟灌流去除血管內(nèi)血細(xì)胞后取出肺組織。用含有200μg/ml的膠原酶D和40μg/ml的DNaseⅠ的培養(yǎng)液在37℃的搖床內(nèi)消化處理肺組織1.5小時，300目鋼網(wǎng)過濾后裂解紅

13、細(xì)胞，1500rpm離心后，用2％ FBS-PBS重懸細(xì)胞。
　　6、細(xì)胞膜染色
　　將肺組織單細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×106個/ml。分別加入單克隆抗體(anti-lineage，anti-ST2，anti-CD45)，4℃避光孵育30分鐘，表達(dá)CD45+Lin-ST2+的細(xì)胞為天然輔細(xì)胞(NHCs)。
　　結(jié)果：
　　1、初次RSV感染時間影響再次感染時氣道炎癥反應(yīng)
　　與成年期初次感染RSV組相比，新生

14、期初次RSV感染誘導(dǎo)更多的炎性細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤肺組織。HE染色亦觀察到新生期初次感染組肺組織炎性細(xì)胞浸潤明顯，小支氣管和周圍組織有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。
　　2、初次RSV感染時間影響成年期再次感染時肺組織局部細(xì)胞因子分泌水平
　　與初次感染發(fā)生在成年期鼠相比，新生期初次RSV感染組肺泡灌洗液中的Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13含量明顯升高，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ含量位于檢測水平以下;通過real-

15、time RT-PCR檢測肺組織分泌的Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13mRNA增多，肺組織內(nèi)Th1型細(xì)胞因子IFN-γmRNA明顯減少。
　　3、初次RSV感染時間影響再次感染時肺組織局部NH細(xì)胞數(shù)量及其Th2型細(xì)胞因子分泌活性
　　與初次成年RSV感染組相比，新生期初次RSV感染組肺組織局部浸潤的NH細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時Th2型細(xì)胞因子IL-5+-NHCs、IL-13+-NHCs數(shù)亦明顯增多，但分泌Th1型細(xì)胞因子I

16、FN-γ+-NHCs數(shù)量變化不明顯。當(dāng)利用磁珠分選模型鼠肺組織內(nèi)CD45+Lin-ST2+的天然輔助細(xì)胞，再通過real-time RT-PCR檢測NH細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示新生期初次RSV感染組，肺組織局部內(nèi)NH細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-5 mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)水平明顯高于成年初次感染組，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ mRNA升高并不明顯，提示新生期初次RSV感染可能通過誘導(dǎo)Th2型NH細(xì)胞肺浸潤，加

17、重感染鼠肺局部炎癥。
　　4、過繼回輸肺NH細(xì)胞加重成年期再次感染時所誘發(fā)的氣道炎癥
　　與未回輸NH細(xì)胞鼠相比，過繼回輸NH細(xì)胞BALB/c鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞肺組織局部浸潤明顯;肺的病理切片顯示，過繼回輸NH細(xì)胞導(dǎo)致肺炎癥加重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，新生期初次感染RSV，肺泡灌洗液中細(xì)胞因子Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13明顯增加，但Th1型細(xì)胞因子分泌量低于檢測水平，但新生期初次RSV感