丹皮酚和ZBd-2在慢性炎癥痛中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　慢性疼痛是骨科常見的癥狀，治療難度大，其中樞調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完善。中藥牡丹皮為毛茛科植物牡丹的干燥根皮，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和防治血栓等多種藥理作用，丹皮酚為其最重要的活性化合物，但其在慢性炎癥痛的中樞鎮(zhèn)痛作用機(jī)制并不清楚。ZBD-2為本實(shí)驗(yàn)室新合成的轉(zhuǎn)位蛋白(TSPO)受體激動(dòng)劑，可以通過激活TSPO受體，增強(qiáng)中樞GABA受體功能，恢復(fù)E/I平衡，可能具備發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗焦慮作用。而ZBD-2對(duì)慢性疼痛以及其導(dǎo)致的精神障礙的研究

2、較少。本研究旨在探索丹皮酚和ZBD-2對(duì)完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的小鼠慢性炎癥痛及焦慮的作用及其可能的機(jī)制。
　　研究方法：
　　丹皮酚在慢性炎癥痛中的作用及機(jī)制研究的方法:小鼠足底注射10μl的50％CFA到小鼠左足底部建立慢性炎癥性疼痛模型，采用標(biāo)準(zhǔn)的Von Frey纖維評(píng)價(jià)機(jī)械痛閾值，采用熱板檢測(cè)熱痛閾值，后記錄慢性炎癥痛小鼠在曠場(chǎng)中的活動(dòng)能力。Western blot檢測(cè)小鼠前扣帶回區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)，并采用免疫熒光方

3、法分析小鼠ACC區(qū)s6和ps6的分布情況。
　　ZBD-2在慢性炎癥痛誘導(dǎo)的焦慮樣行為的作用及機(jī)制研究，建立慢性炎癥痛模型，測(cè)定小鼠機(jī)械痛和熱痛閾值，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠注射部位的足底厚度。采用高架十字迷宮檢測(cè)小鼠進(jìn)入開、閉臂次數(shù)和滯留時(shí)間，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離及在中央?yún)^(qū)的活動(dòng)時(shí)間。處死小鼠后Western blot檢測(cè)小鼠前杏仁核區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)，使用全細(xì)胞膜片鉗記錄了注射3周CFA的小鼠杏仁核區(qū)的mEPSC以及

4、mlPSC電流。
　　研究結(jié)果：
　　Von Frey結(jié)果表明，丹皮酚處理后可以逆轉(zhuǎn)小鼠注射側(cè)足底縮足閾值的下降。在熱痛實(shí)驗(yàn)中，丹皮酚處理后可以逆轉(zhuǎn)小鼠注射側(cè)足底熱輻射刺激潛伏期的縮短;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組小鼠的總運(yùn)動(dòng)距離沒有顯著差別。丹皮酚處理后明顯逆轉(zhuǎn)了CFA引起小鼠ACC區(qū)GluR1、p-GluR1-Ser831、NR2B和CaMKIIα的上升，各組NR2A，p-GluR1-Ser845受體的表達(dá)沒有明顯差異。各組小鼠

5、ACC區(qū)GABAA-α2受體表達(dá)表達(dá)沒有明顯變化。丹皮酚顯著逆轉(zhuǎn)p-mTOR、p-S6K、p-S6和p-4EBP的上調(diào)，各組mTOR、S6K、S6以及4EBP的表達(dá)沒有差異。免疫熒光的結(jié)果證實(shí)了ACC區(qū)S6和PS6的變化。丹皮酚顯著逆轉(zhuǎn)了CFA引起的ACC區(qū)p-ERK和p-CREB表達(dá)上調(diào)。各組ERK1/2和CREB表達(dá)沒有明顯差異。
　　ZBD-2處理不能逆轉(zhuǎn)小鼠注射側(cè)熱輻射潛伏期及機(jī)械痛閾值的下降;ZBD-2處理后沒有改變CF

6、A引起的小鼠注射部位足底厚度的增加。在高架十字迷宮測(cè)試中，ZBD-2可以計(jì)量依賴的逆轉(zhuǎn)CFA引起的小鼠開臂滯留時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)顯著的下降。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)入迷宮各臂總次數(shù)沒有明顯改變。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZBD-2能劑量依賴的逆轉(zhuǎn)CFA引起的小鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間的下降。各組小鼠的在曠場(chǎng)中的總運(yùn)動(dòng)距離沒有顯著差別。ZBD-2可以逆轉(zhuǎn)CFA模型小鼠杏仁核TSPO受體的上調(diào)。ZBD-2處理組明顯逆轉(zhuǎn)CFA所引起的小鼠杏仁核區(qū)NR2A、NR

7、2B、GluR1和CaMKIIα蛋白的上調(diào)。各組小鼠基底杏仁核內(nèi)GABAA-α2以及GAD67表達(dá)量沒有明顯變化。全細(xì)胞膜片鉗記錄CFA注射3周后的BLA椎體神經(jīng)元興奮性(mEPSC)和抑制性微突觸后電流變化(mIPSC)。ZBD-2治療后可以顯著降低mEPSC的頻率和振幅，顯著增加mIPSC振幅，而各組小鼠mIPSC的頻率沒有明顯改變。
　　研究結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚對(duì)慢性炎癥痛模型小鼠有明顯鎮(zhèn)痛作用。發(fā)現(xiàn)丹皮

8、酚可以逆轉(zhuǎn)CFA小鼠ACC區(qū)NR2B，CaMKIIα，GluR1，p-GluR1-Ser831，ERK/CREB和mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的上調(diào)，但對(duì)ACC區(qū)NR2A，p-GluR1-Ser845和GABAA-α2沒有明顯影響。這些結(jié)果表明。丹皮酚能夠減少CFA引起的小鼠慢性炎性痛，或許是通過逆轉(zhuǎn)ACC區(qū)谷氨酸相關(guān)受體、mTOR及ERK/1/2/CREB信號(hào)通路表達(dá)異常發(fā)揮作用。
　　CFA注射21天后小鼠可以產(chǎn)生慢性炎癥痛并誘發(fā)