過(guò)量atRA對(duì)胎鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討過(guò)量全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）小鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　取周齡為10周左右的SPF級(jí)C57BL/6J近交系小鼠(雌鼠40只，雄鼠20只)，于前一天晚8時(shí)按雌雄比2:1進(jìn)行合籠交配。以次日早晨觀察到陰栓陽(yáng)性的雌鼠標(biāo)記為妊娠0天(gestation day0, GD0)，共獲得30只孕鼠，隨機(jī)分組后，每組15只。在GD10時(shí)，實(shí)驗(yàn)

2、組以一次性灌胃給藥的方式給予孕鼠100mg/kg的atRA，對(duì)照組孕鼠灌以等量玉米油。分別取兩組GD13、14、15和16時(shí)灌胃時(shí)點(diǎn)的胎鼠標(biāo)本，利用HE染色連續(xù)觀察胎鼠腭板發(fā)育情況。
　　我們建立GD13胎鼠腭突間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，利用生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第三代胎鼠腭間充質(zhì)(mouse embryonic palate mesenchymal, MEPM)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，根據(jù)atRA作用濃度，實(shí)驗(yàn)共分為5組(0.1μmol/L、0

3、.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，并設(shè)空白對(duì)照組。atRA作用時(shí)間分別為：24h、48h和72h。利用臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT法檢測(cè)atRA對(duì)MEPM細(xì)胞活性的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系，由此結(jié)合 RA的臨床藥理特點(diǎn)，選擇適宜的時(shí)間和濃度，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。利用Real-time PCR檢測(cè)過(guò)量atRA對(duì)Smad2、Smad7 mRNA表達(dá)的影響， Western blot方法檢測(cè)過(guò)量atRA對(duì)MEPM細(xì)胞內(nèi)

4、蛋白Smad2、Smda7和p-Smad2蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為雙側(cè)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組GD13、14、15和16胎鼠雙側(cè)腭板完成上抬、接觸及融合過(guò)程；而與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 GD13胎鼠雙側(cè)腭板體積較小，且并未觀察到雙側(cè)腭板上抬；GD14時(shí)，實(shí)驗(yàn)組胎鼠雙側(cè)腭板未上抬，可觀察到發(fā)育明顯延遲；GD15時(shí)，實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)腭板仍未發(fā)生接觸，最終在

5、GD16時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組胎鼠兩側(cè)腭板形成腭裂。
　　臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，隨atRA作用時(shí)間及濃度增加細(xì)胞拒染率逐漸降低，提示隨atRA作用時(shí)間及濃度增加，細(xì)胞活性逐漸下降；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：atRA濃度在0.1-10μmol/L范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，MEPM細(xì)胞吸光度值為遞減趨勢(shì)，MEPM細(xì)胞活性隨著atRA濃度增加細(xì)胞活性逐漸下降，尤其是加藥72小時(shí)后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。我們利用SPSS17.0分

6、析得到atRA作用72小時(shí)對(duì)MEPM細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為：4.76μmol/L。實(shí)時(shí)定量Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組(5μmol/L atRA)可促進(jìn)Smad7 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而對(duì)Smad2 mRNA表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5μmol/L atRA可下調(diào) p-Smad2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Smad7蛋白表達(dá)，但對(duì)Smad2蛋白表達(dá)并無(wú)影響(P