大黃素對RA成纖維樣滑膜細胞PI3K-AKT信號通路的抑制作用.pdf

1、目的：
　　探討大黃素對原代類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖與遷移的影響，以及對MH7A細胞株PI3K/AKT信號通路及下游分子的作用機制。
　　方法：
　　采用組織塊提取法和酶消化法體外培養(yǎng)類風濕關節(jié)炎滑膜細胞，分別加入不同濃度大黃素（0、20、40、60、80、100μmol/L）培養(yǎng)6、12、24h，CCK-8法檢測增殖能力的變化及時效關系；Transwell法檢測處理前后遷移能力的變化。采用流式細胞術檢測（40

2、、60、80μmol/L）大黃素處理12h后MH7A細胞株凋亡和增殖周期情況；免疫熒光法檢測（空白組、TNF-α組、TNF-α+Emodin(60μM)組、LY294002組）處理12h后，MH7A細胞株內PI3K、AKT表達變化情況；Western Blot法檢測（空白組、TNF-α組、TNF-α+Emodin(40μM)組、TNF-α+Emodin(60μM)組、TNF-α+Emodin(80μM)組、LY294002組）處理12h

3、后PI3K、AKT及其信號通路下游分子Bax、Bcl-2、Caspase-8的表達情況；qRT-PCR檢測（空白組、TNF-α組、TNF-α+Emodin(40μM)組、TNF-α+Emodin(60μM)組、TNF-α+Emodin(80μM)組、LY294002組）處理12h后PI3K及AKT mRNA的表達情況。
　　結果：
　?。?）酶消化法和組織塊法分別于14d和21d得到原代RA成纖維樣滑膜細胞，擴大培養(yǎng)3代后用

4、大黃素處理。
　?。?）CCK-8檢測6 h處理后20、40、60、80、100μmol/L大黃素的抑制率依次為0.39±0.11、0.51±0.04、0.55±0.07、0.72±0.18、0.98±0.11。且隨著處理時間延長，抑制率增加（P＜0.05）。
　　（3）Transwell法檢測濃度為20、40、80μmol/L大黃素處理后，處理組穿過小室膜的細胞數(shù)明顯少于對照組，遷移試驗表明，抑制率分別為39.48%、54

5、.76%、82.99%。侵襲試驗表明，抑制率分別為25.38%、60.41%、81.73%。與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　?。?）流式細胞術檢測大黃素可促進MH7A細胞株凋亡，并具有濃度依賴性，與空白組對比，凋亡率隨著濃度的增高而增高（P＜0.05）；檢測不同濃度大黃素對MH7A細胞株增殖周期的影響結果顯示與空白組相比，隨著大黃素濃度升高，S相的百分比從14.41%增加到20.64%，而G2相的百分比從11

6、.52下降%至5.09%。
　?。?）免疫熒光法檢測在MH7A細胞中，TNF-a處理后，PI3K、AKT表達熒光反應增強；大黃素處理后，PI3K、AKT的表達量較TNF-a處理組表達顯著減少；而LY294002處理組，較其他組比較，其PI3K、AKT表達最弱。
　　（6）大黃素處理后MH7A細胞中PI3K、AKT蛋白及mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），并呈濃度依賴性。
　?。?）大黃素處理后PI3K/AKT信

7、號通路下游分子Caspase-8的蛋白表達明顯降低，Bax/bcl-2的表達明顯增高，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　?。?）不同濃度的大黃素對體外培養(yǎng)RA-FLSs的遷移及增殖具有抑制作用，且具有一定的量效和時效關系；
　　（2）大黃素可以促進MH7A細胞株凋亡，同時將其增殖阻斷于S期。
　?。?）大黃素通過作用于PI3K/AKT信號通路抑制滑膜細胞的增殖，從而緩解RA患者滑膜