登革2型病毒包膜E蛋白中和表位的確定及其功能分析.pdf

1、在登革病毒編碼的三種結(jié)構(gòu)蛋白中，包膜E蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于成熟病毒顆粒表面，構(gòu)成病毒顆粒的突起。E蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(I，Ⅱ和Ⅲ區(qū))，在病毒吸附、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用。而且，E蛋白也是病毒的主要抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保、護(hù)性免疫應(yīng)答，在機(jī)體抵御登革病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。然而，登革病毒E蛋白，特別是Ⅲ區(qū)外的構(gòu)象型中和表位的精細(xì)結(jié)構(gòu)尚未完全闡明。其次，不同型

2、和同一型毒株之間在抗體結(jié)合位點(diǎn)上的差異及其對(duì)病毒組織嗜性、復(fù)制效率及致病性等的影響也還有待于進(jìn)一步分析。此外，E蛋白上與登革病毒免疫病理密切相關(guān)的ADE表位也知之甚少。這些問題阻礙了對(duì)登革病毒致病和免疫分子機(jī)理的闡明。因此，確定登革病毒E蛋白中和表位和ADE表位，闡明抗體中和作用的分子機(jī)制，以及進(jìn)一步探討與E蛋白重要生物學(xué)功能相關(guān)的一些關(guān)鍵氨基酸殘基，不僅是了解其分子機(jī)制的第一步，也為登革特異性防治提供重要信息。
　　 本項(xiàng)研究

3、利用登革2型病毒E蛋白特異單抗，分析了病毒E蛋白的中和表位，明確了抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)及其中和作用的機(jī)制，并初步探討了重要氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響。研究主要包括四個(gè)部分：
　　 一、登革2型病毒包膜E蛋白特異單克隆抗體的制備
　　 為了制備登革2型病毒E蛋白特異單抗，我們分別以滅活的登革2型病毒和構(gòu)建的病毒全長(zhǎng)prM-E基因的真核重組質(zhì)粒DNA作為免疫原，采用常規(guī)方法建立分泌登革2型病毒E蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞系

4、。最終獲得了10株登革2型病毒特異單抗(2B8、2H11、2D7、2F2、2F10、2A10G6、2B4、2D5、4C10和6B4).
　　 為了對(duì)這10株單抗所針對(duì)的病毒蛋白進(jìn)行鑒定，我們以穩(wěn)定表達(dá)登革2型病毒prME蛋白的細(xì)胞制備的抗原片對(duì)其進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，這10株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗均是針對(duì)prM-E抗原的。然后，以大腸桿菌表達(dá)的E蛋白Ⅰ-Ⅱ區(qū)或Ⅲ區(qū)為抗原，采用免疫印跡和ELISA法鑒定單抗所針對(duì)的抗原表位。結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)，除2A10G6和2F10結(jié)合E蛋白I-Ⅱ區(qū)外，其余單抗均針對(duì)E蛋白Ⅲ區(qū)。此外，對(duì)這些單抗的交叉反應(yīng)活性測(cè)定結(jié)果顯示，2B8、2H11、2D7和2F2是登革2型病毒特異的，而其余6株均具有黃病毒交叉反應(yīng)活性。上述結(jié)果表明，我們獲得了針對(duì)登革2型病毒E蛋白不同的結(jié)構(gòu)域、對(duì)黃病毒屬成員具有不同反應(yīng)性的單抗，為E蛋白抗原表位分析、登革新的診斷試劑以及新型疫苗和抗病毒藥物研究提供重要工具。
　　 二、登革2型病毒E蛋白特異單克隆抗

6、體的中和作用機(jī)制
　　 我們采用蝕斑中和減少試驗(yàn)和乳鼠保護(hù)試驗(yàn)觀察這10株登革2型病毒E蛋白特異單抗的中和活性和保護(hù)作用。結(jié)果顯示，三株單抗(2B8、2A10G6和2F10)對(duì)登革2型病毒具有較強(qiáng)的中和活性和免疫保護(hù)作用。其中E蛋白I-II區(qū)特異單抗2A10G6強(qiáng)于Ⅲ區(qū)特異單抗2B8，該抗體可在登革病毒感染4h和24h后分別使66.7％和40%的小鼠存活。此外，單抗2A10G6還有效中和登革l、3和4型、黃熱和西尼羅病毒，與目前

7、已知的黃病毒交叉中和抗體比較，具有更加廣譜的黃病毒交叉中和活性。
　　 為了確定登革病毒E蛋白特異抗體中和作用的機(jī)制，我們采用定量RT-PCR法和蝕斑法測(cè)定單抗(2B8和2A1OG6)是在病毒增殖周期中的哪一個(gè)階段抑制病毒的感染。結(jié)果顯示，2B8主要抑制登革病毒增殖周期中的吸附階段，抑制倍數(shù)達(dá)3.1；而2A10G6可在病毒吸附后的病毒E蛋白與宿主細(xì)胞膜融合階段發(fā)揮其中和作用。上述結(jié)果說(shuō)明，這2株中和抗體可通過結(jié)合其不同的中和表位

8、在病毒增殖周期的初期階段抑制登革病毒的感染。另一方面，我們?cè)谌藛魏思?xì)胞K562上觀察了亞中和濃度的單抗2A10G6是否可增強(qiáng)登革1-4型病毒對(duì)表達(dá)Fcy受體的單核細(xì)胞的感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞中和濃度的單抗2A10G6可增強(qiáng)4個(gè)型登革病毒對(duì)單核細(xì)胞的感染，增加倍數(shù)達(dá)5-10倍，表明該中和抗體具有感染增強(qiáng)活性。
　　 三、登革2型病毒E蛋白中和表位的篩選與鑒定
　　 為了分析登革病毒E蛋白中和表位，我們首先采用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì)單

9、抗2A10G6結(jié)合的多肽進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，該單抗所對(duì)應(yīng)的多肽序列位于登革2型病毒E蛋白融合多肽的98DRXW101區(qū)域。采用ELISA法進(jìn)一步證實(shí)了相應(yīng)的合成多肽可與單抗2A10G6特異結(jié)合。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該多肽序列在所有黃病毒的E蛋白氨基酸序列中是高度保守的。根據(jù)E蛋白晶體結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)由D98、R99和W101位氨基酸殘基可構(gòu)成一個(gè)2A10G6結(jié)合的構(gòu)象型表位，該表位暴露在登革2型病毒E蛋白Ⅱ區(qū)頂端融合多肽的表面，且其空間構(gòu)象在不

10、同黃病毒E蛋白結(jié)構(gòu)中是較為保守的。
　　 為了確定單抗2A10G6與E蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，我們利用免疫印跡觀察D98、R99和W101位突變對(duì)抗體結(jié)合活性的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)D98R和R99G單獨(dú)突變時(shí)，2A10G6與E蛋白的結(jié)合不受影響；當(dāng)W101R突變時(shí)，2A10G6幾乎不能與E蛋白結(jié)合。當(dāng)這些氨基酸位點(diǎn)組合突變時(shí)，2A10G6結(jié)合活性基本上喪失。表明登革病毒E蛋白融合多肽內(nèi)的W101位可能是2A10G6與其結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),

11、而D98和R99位氨基酸對(duì)抗體結(jié)合也可產(chǎn)生一定的影響。
　　 此外，我們通過抗體壓力篩選和蝕斑純化，獲得了1株可逃逸單抗2A10G6中和的突變株。序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該突變株在登革2型病毒E蛋白第126位處氨基酸發(fā)生了突變(Glu→Lys)，表明登革2型病毒E蛋白126位氨基酸是單抗2A10G6特異識(shí)別的氨基酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)可與D98、R99和W101位共同形成2A10G6表位。同時(shí)，這株逃逸株具有與親本株相似的病毒復(fù)制效率，但乳鼠神經(jīng)

12、毒力明顯降低，表明E蛋白126位氨基酸是登革2型病毒的毒力相關(guān)位點(diǎn)。
　　 四、登革2型病毒E蛋白特異嵌合抗體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　 為了探討抗體Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)器功能以及為下一步構(gòu)建人源化抗體提供理論依據(jù)，我們首先用5’RACE法測(cè)定并預(yù)測(cè)了鼠源抗體2A1OG6的輕重鏈可變區(qū)序列中可能的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region，CDR)和框架區(qū)(Frameworkregion

13、，F(xiàn)R)。結(jié)果顯示，重鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列依次為EYTMH、GIDPNNGGTNYNQKFKG和RDYYALDY；輕鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列依次為KASQHVGSAVA、SASNRYT和QQYNSYPT。在此基礎(chǔ)上，我們分別構(gòu)建了嵌合抗體輕重鏈的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418壓力篩選獲得可穩(wěn)定分泌登革病毒E蛋白特異嵌合抗體的細(xì)胞株，且該抗體具有與親本鼠源抗體相似的抗原結(jié)合和中和活性。
　　 本研究