登革2型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2B的表達(dá)、純化及其抗體制備.pdf

1、登革病毒(dengueviruses，DV)屬于黃病毒屬(Flavivirus)，根據(jù)E蛋白的抗原性不同，可分4種血清型(DV21-4)。它由主要由埃及伊蚊傳播，引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥。全世界大約有40％的人居住在熱帶和亞熱帶地區(qū)，屬于感染的高危人群。每年全世界大約有1億人感染登革出血熱，死亡率約為5％。到目前為止，尚無安全有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和特效抗DV藥物進(jìn)行治療。可見DV感染已是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 DV2

2、是有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約11KD，編碼一個(gè)多肽鏈后，在宿主的信號(hào)肽酶和病毒編碼的蛋白酶作用下裂解為三種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。在黃病毒屬蛋白酶作用其自身編碼的多聚蛋白底物的過程中，需要活化蛋白或者輔助因子使蛋白酶的達(dá)到最佳活性，目前認(rèn)為NS2B即是一個(gè)重要的輔助因子，在激活NS3蛋白酶和NS2B-NS3異二聚體中發(fā)揮作用，因而成為研究

3、者關(guān)注的靶點(diǎn)。 NS2B是亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)膜內(nèi)蛋白。在相對(duì)區(qū)分NS2B疏水性區(qū)域的基礎(chǔ)上分為七個(gè)區(qū)域(Ⅰ一Ⅶ)，其中，Ⅳ(G69-E80)為疏水的核心區(qū)，能夠直接與NS3蛋白酶結(jié)合。其側(cè)面的兩個(gè)親水性區(qū)域(Ⅲ-Ⅴ)，用突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)顯示NS2B的40個(gè)氨基酸圍繞在Ⅲ到Ⅴ區(qū)，是最佳刺激NS3蛋白酶的活性區(qū)域。而且，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，NS2B-NS3蛋白酶的活性也是由這個(gè)親水性片段介導(dǎo)的。目前，正在從分子學(xué)

4、結(jié)構(gòu)證明NS2B輔助因子激活蛋白酶的活性機(jī)制。NS2B除了激活蛋白酶的活性外，還能促進(jìn)NS3與膜的融合，是NS3誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要輔助因子。 NS2B在病毒復(fù)制過程中的作用目前尚不十分清楚，重要原因之一是缺乏特異性的顯示手段，為進(jìn)一步研究NS2B蛋白在DV2感染過程中的作用和作為新檢測靶抗原的可能性，本課題構(gòu)建NS2B蛋白的原核和真核表達(dá)載體，經(jīng)過克隆、表達(dá)和純化，制備了抗NS2B的多克隆抗體，為下一步研究工作提供了免疫學(xué)

5、工具。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下： 一.DV2NS2B蛋白的原核表達(dá)、抗血清的制備及其生物學(xué)特性的初探 1.NS2B的原核表達(dá)、抗血清的制備 利用RT-PCR以DV2mRNA為模板擴(kuò)增出DV2NS2B編碼基因NS2B。將NS2B全長基因插入原核表達(dá)載體pQE31，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得的pQE-NS2B/JM109工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，超聲裂解提取表達(dá)產(chǎn)物，融合蛋白NS2B以包涵體的形式存

6、在。包涵體裂解液經(jīng)Ni-NTA親和純化后，獲得大小相符的特異目標(biāo)蛋白條帶。經(jīng)Westernblot證實(shí)為所需目的蛋白。目的蛋白經(jīng)純化復(fù)性后免疫BALB/c小鼠，獲得了抗體效價(jià)較高的抗血清，經(jīng)ELISA檢測，鼠抗血清效價(jià)達(dá)到了1:12800。利用Westernblot和間接免疫熒光證實(shí)，抗血清能特異性地識(shí)別DV2NS2B蛋白。NS2B抗血清的成功制備為進(jìn)一步研究NS2B在DV2感染機(jī)制中的作用提供良好的工具。 2.DV2NS2B

7、多克隆抗體的生物學(xué)功能 通過PRNT檢測，DV2NS2B產(chǎn)生的抗血清中和病毒的作用不明顯，可能不具有免疫保護(hù)作用；收集DV2感染后不同時(shí)間點(diǎn)的ECV304細(xì)胞，免疫熒光檢測顯示：感染12h后用NS2B抗血清能檢測到NS2B抗原，隨著感染時(shí)間的延長，NS2B蛋白在細(xì)胞內(nèi)的含量也隨著增加；激光共聚焦顯示：NS2B蛋白與NS3蛋自在感染12h、24h和48h后的ECV304細(xì)胞核周和胞質(zhì)中有共存區(qū)域。 二、DVNS2B蛋白

8、在真核表達(dá)載體的克隆、表達(dá)及其DNA免疫 1.真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2B的構(gòu)建 通過PCR擴(kuò)增出DV2NS2B編碼基因。將NS2B全長基因插入真核表達(dá)載體pCAGGS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue，獲得pCAGGS-P7/NS2BXL-Blue工程菌。超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2BDNA后，利用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Vero，間接免疫熒光染色顯示NS2B蛋白的表達(dá)，該質(zhì)粒命名為：pCAGGS-P7

9、/NS2B。 2.pCAGGS-P7/NS2B質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠 經(jīng)大規(guī)模超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2BDNA后，注射到BALB/c小鼠后，經(jīng)ELISA檢測，鼠抗血清效價(jià)達(dá)到了1:2000，利用Westernblot和間接免疫熒光證實(shí)，DNA免疫產(chǎn)生的NS2B抗血清能特異性地識(shí)別DV2NS2B蛋白。 本研究分別用原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載構(gòu)建的NS2B重組質(zhì)粒，分別以蛋白免疫和DNA免疫