廣東登革2型及4型病毒致病性研究及毒力位點分析.pdf

1、登革熱是登革病毒引起的、世界上最重要的蟲媒傳染病之一，根據(jù)臨床癥狀分為普通登革熱與重癥登革熱。近30年，登革熱疫情迅速擴大，重癥病例顯著增加，雖然重癥登革熱的發(fā)病機制尚未完全闡明，但病毒毒力被普遍認為是重要的致病因素之一。廣東省位于亞熱帶，氣候潮濕，伊蚊密度高，是我國登革熱的高發(fā)地區(qū)，發(fā)生過登革4種血清型病毒的流行。近年來，登革熱疫情在該地區(qū)呈快速上升趨勢。由于對廣東地區(qū)登革病毒流行株的致病性知之甚少，嚴重阻礙了我國登革熱疫情的有效預防

2、與控制。因此，深入了解廣東地區(qū)登革病毒流行株的致病性，并通過毒力位點分析，從基因水平初步闡述該地區(qū)登革病毒的毒力變化規(guī)律，對于指導我國登革熱疫情的科學防控具有重要意義，也為登革病毒的毒力研究提供依據(jù)。
　　一、目的：
　　研究廣東地區(qū)登革2型及4型病毒的致病性，分析可能導致毒力差異的關鍵位點，初步闡明廣東地區(qū)近年來登革2型及4型病毒分離株在關鍵毒力位點上的差異，為我國登革熱疫情的科學防控提供理論依據(jù)。
　　二、方法：<

3、br>　　1、DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30的致病性研究：
　　1）研究對象：對廣東2010年登革2型病毒流行株-廣州40株（DENV-2-GZ40）及廣東2010年登革4型病毒流行株-廣州30株（DENV-4-GZ30）的致病性進行研究，并分別與1987年登革2型病毒廣西43株（DENV-2-GX43）及1990年登革4型病毒廣州 B5株（DENV-4-GZB5）對比分析。
　　2） DENV-2-GZ40

4、、 DENV-4-GZ30對 C6/36細胞的致病性：分別將DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接種 C6/36細胞，初步觀察細胞病變，并繪制病毒在 C6/36細胞上的生長曲線；
　　3）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30對 BHK-21細胞的致病性：分別將DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接種 BHK

5、-21細胞，初步觀察細胞病變，進一步采用噬斑實驗觀察病毒在 BHK-21細胞上的噬斑大小及形態(tài)，繪制病毒在 BHK-21細胞上的生長曲線。為了明確 DENV-2-GZ40對 BHK-21細胞的感染性，采用實時定量 RT-PCR方法測定感染細胞上清液中病毒量及間接免疫熒光實驗檢測感染細胞內(nèi)的病毒抗原；
　　4）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30對乳鼠的神經(jīng)毒力：采用腦內(nèi)注射途徑感染昆明乳鼠，觀察乳鼠發(fā)病、死亡情況，計算其

6、對乳鼠的 LD50。
　　2、毒力位點分析：
　　1）分別比對 DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43、 DENV-4-GZ30與DENV-4-GZB5全基因序列，分析可能導致毒力差異的位點；
　　2）在 GenBank上搜索廣東地區(qū)近年來登革2型、4型分離株的全基因序列，比對其在關鍵毒力位點的差異，推測差異可能導致的毒力變化。
　　三、結果：
　　1、登革2型病毒 GZ40的致病性：
　　

7、在 C6/36細胞上，DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43均于接種3天后出現(xiàn)典型細胞病變，但 DENV-2-GZ40復制滴度稍低于 DENV-2-GX43。在 BHK-21細胞上，兩毒株也于接種3天后出現(xiàn)細胞病變，DENV-2-GX43能形成清晰噬斑，直徑0.44mm，DENV-2-GZ40不能形成噬斑；雖然感染 DENV-2-GZ40的 BHK-21細胞上清液及細胞內(nèi)均可檢測出病毒且病毒量隨著感染時間延長而增加，但DENV

8、-2-GZ40在 BHK-21細胞的復制水平明顯低于 DENV-2-GX43。腦內(nèi)注射DENV-2-GZ40病毒組乳鼠發(fā)病時間較腦內(nèi)注射 DENV-2-GX43病毒組延遲，發(fā)病率低，其 LD50為606PFU，DENV-2-GX43對乳鼠 LD50為0.67PFU。
　　2、登革2型病毒的基因組差異及毒力位點分析：
　　DENV-2-GZ40與 DENV-2-GX43在5’UTR有5個核苷酸差異，3’UTR有16個核苷酸差異

9、，編碼區(qū)有80個氨基酸差異，其中37個位點發(fā)生了電荷或疏水性的改變。毒力位點 E52、E71、E126及可能的毒力位點5’UTR-78、NS2A-139、NS4B-108、E116、E149、E184差異可能是導致 DENV-2-GZ40毒力減弱的原因。2001-2013年廣東地區(qū)在 GenBank上有7株登革2型病毒全基因序列，在 E193、E203、NS1-164毒力位點有差異。
　　3、登革4型病毒 GZ30的致病性：

10、>　　在 C6/36細胞上，DENV-4-GZB5于接種7天后出現(xiàn)細胞病變，DENV-4-GZ30接種細胞后未觀察到典型病變，兩毒株在 C6/36細胞上的復制水平相似。在BHK-21細胞上，兩毒株均于接種2天后出現(xiàn)相似細胞病變，均能在 BHK-21細胞上形成噬斑，DENV-4-GZ30噬斑清晰，平均直徑為0.35mm，DENV-4-GZB5噬斑彌散，平均直徑為0.48mm，兩者在 BHK-21細胞上復制水平相似。腦內(nèi)注射 DENV-4-

11、GZ30病毒組乳鼠發(fā)病時間較腦內(nèi)注射 DENV-4-GZB5病毒組延遲，發(fā)病率低，其 LD50為297PFU，DENV-4-GZB5對乳鼠 LD50為0.35PFU。
　　4、登革4型病毒的基因組差異及毒力位點分析：
　　DENV-4-GZ30與 DENV-4-GZB5在5’UTR有4個核苷酸差異，3’UTR有13個核苷酸不同及 DENV-4-GZ30有一段長13nt（10289-10302）的缺失，編碼區(qū)有94個氨基酸差異

12、，其中37個發(fā)生了電荷或疏水性改變。毒力位點 E120、NS5-201及 E46、E147、E221、E265差異可能與 DENV-4-GZ30減毒相關。1978-2013年廣東地區(qū)在 GenBank上有6株登革4型病毒全基因序列，在 prM127、E155、NS5-201及 NS5-879毒力位點有差異。
　　四、結論：
　　1、DENV-2-GZ40株對 C6/36、BHK-21細胞系及乳鼠致病力弱，與其基因組部分位點變