登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)抗體中和表位與功能研究.pdf

1、登革病毒(DENV)是引起人類疾病的蚊傳播病毒，它能導(dǎo)致無癥狀感染、登革熱(DF)和更嚴(yán)重的登革出血熱（DHF）或登革休克綜合征(DSS)。登革疾病的負(fù)擔(dān)在熱帶和亞熱地區(qū)日益增加，特別是在南美、東南亞和加勒比地區(qū)，在非洲和中東的報(bào)道也越來越多。而在我國南方地區(qū)，幾乎每年都發(fā)生DF流行。登革疾病的流行形勢越來越嚴(yán)峻，其致病機(jī)理還沒有完全弄清楚，但是病毒、宿主的免疫史和個(gè)體的遺傳背景在登革嚴(yán)重疾病的發(fā)生中都起著重要作用。其中，病毒本身的作用

2、很關(guān)鍵。任何一種血清型DENV造成的初次感染都可能使個(gè)體在感染不同于初次感染的異型血清型（heterotypic serotype）DENV時(shí)，病毒載量增加、潛伏期縮短，從而引起DHF/DSS的機(jī)率也大大增加。這與引起再次感染的病毒血清型、基因型、病毒序列以及初次與再次感染的間隔時(shí)間都有關(guān)系。
　　 為應(yīng)對日益增加的登革疾病，很多研究機(jī)構(gòu)都在加緊研發(fā)登革疫苗。目前，已經(jīng)有幾類疫苗在進(jìn)行臨床前的評價(jià)，包括減毒活疫苗、滅活病毒疫苗、

3、基于重組蛋白的亞單位疫苗和裸DNA疫苗等。由于采用基于減毒活疫苗的傳統(tǒng)方法，還沒有研制出可批準(zhǔn)使用的疫苗，研究者更多地將目光轉(zhuǎn)向重組亞單位疫苗。盡管研究登革疫苗是可行的，但是其研發(fā)還是面臨著相當(dāng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn):(1)登革疫苗必須能對4種血清型DENV的感染同時(shí)提供保護(hù)作用，因而需要研制四價(jià)疫苗;(2)登革疫苗要能提供長期的保護(hù)。因?yàn)橛醒芯繄?bào)道，初次感染20年以后的再感染時(shí)仍會(huì)發(fā)生DHF;(3)還沒有合適的復(fù)制登革疾病的動(dòng)物模型;(4)盡管中

4、和抗體的保護(hù)性作用已廣為接受，但其與實(shí)際保護(hù)效果的關(guān)系仍需確定;(5)在DENV的傳播模式和病毒株改變時(shí)，登革疫苗需要重新評價(jià)。因此，要研制出可靠的登革疫苗，就要解決兩方面的難題:一是疫苗的效果，主要指疫苗的保護(hù)性;二是疫苗的安全性問題。
　　 DENV的包膜由脂質(zhì)雙層構(gòu)成，含有兩類包膜相關(guān)蛋白:膜蛋白(envelope，E)和M蛋白(membrane，M)。E蛋白通過結(jié)合到細(xì)胞受體而參與病毒的吸附及穿入后與內(nèi)吞體的融合。E蛋白

5、含有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:結(jié)構(gòu)域Ⅰ(EDⅠ)、EDⅡ、EDⅢ。EDⅢ在病毒顆粒表面是暴露且可及的，而且，重組EDⅢ也能抑制病毒的感染性。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，EDⅢ含有單一血清型特異性(type-specific，TS)表位、針對2～3種血清型DENV的亞復(fù)合體反應(yīng)(sub-complex reactive，sCR)表位以及同時(shí)針對4種血清型DENV的復(fù)合體反應(yīng)(complex reactive，CR)表位，多株鼠源單克隆抗體也分別定位到這些表位。

6、研究表明，許多TS和sCR鼠單抗是針對DENV單抗中起主要中和及保護(hù)作用的單抗。由此，登革病毒EDⅢ蛋白也成為亞單位疫苗很有前景的備選靶標(biāo)。另外，最近有關(guān)人源單抗的研究認(rèn)為，針對EDⅢ的單抗僅占人免疫血清中抗DENV總抗體中的很小一部分，而且EDⅢ上的表位不是人抗DENV中和抗體的主要靶標(biāo)。盡管如此，鼠源單抗的抗原性表位及其中和活性譜仍有許多方面未研究清楚，更加深入的研究對加深了解體液免疫反應(yīng)的復(fù)雜性、改善登革疫苗的免疫策略或研究治療性

7、抗體均有不可替代的作用。
　　 對EDⅢ單抗的抗原性表位和中和活性的研究可加深對疫苗效果的研究，但是，還有一個(gè)難題就是疫苗的安全性問題。前已述及，任何一種血清型登革病毒引起初次感染后，由不同血清型引起再次感染時(shí)，登革疾病加重的機(jī)率大大增加，其背后最主要的機(jī)制就是抗體依賴的增強(qiáng)作用(antibody-dependentenhancement，ADE)，即先前存在交叉反應(yīng)弱中和抗體能與登革病毒結(jié)合，增強(qiáng)表達(dá)FcγR受體的細(xì)胞的感染水

8、平。最近，Dejnirattisai W.等的研究成果也呈現(xiàn)出ADE發(fā)生的復(fù)雜性，即抗E蛋白抗體和抗前膜(precursor membrane，prM)抗體均能增強(qiáng)DEN感染。要研制能提供長期保護(hù)的四價(jià)疫苗，還沒有合適的登革疾病的動(dòng)物模型對登革疫苗進(jìn)行安全性評價(jià)，因此，登革疫苗的體外評價(jià)顯得格外重要。
　　 因此，在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，利用登革病毒重組EDⅢ蛋白免疫小鼠，制備了107株與DENV重組EDⅢ反應(yīng)的單抗。本研究中，我

9、們首先采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和間接免疫熒光(IFA)測定法對107單抗的結(jié)合特異性(binding specificity)進(jìn)行檢測，隨后，我們利用已建立的簡單高通量的微中和試驗(yàn)(ELISPOT-MNT)法對篩選出來的94株單抗的中和活性譜進(jìn)行全面的檢測和分析。在此基礎(chǔ)上，對94株單抗的抗原性位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析，以深入認(rèn)識重組EDⅢ免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生單抗的抗原性位點(diǎn)及其與體外保護(hù)性作用的關(guān)系。然后，我們創(chuàng)新性地建立了簡單高通量的測定

10、DENV ADE效應(yīng)的方法學(xué)，以進(jìn)行疫苗安全性的評價(jià)和登革疾病的風(fēng)險(xiǎn)評估。
　　 由此，本研究的主要目的有三個(gè):第一，對107株單抗的結(jié)合特異性和體外保護(hù)性作用進(jìn)行鑒定;第二，對篩選出來的94株單抗識別的抗原性位點(diǎn)進(jìn)行分析;第三，建立一種簡單高通量的測定登革抗體ADE活性的新方法，實(shí)現(xiàn)對登革疫苗體外安全性評價(jià)。
　　 由此，本研究共分為如下三個(gè)部分的內(nèi)容:
　　 第一部分登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)單克隆抗體

11、的結(jié)合特異性和中和活性鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，采用畢赤酵母表達(dá)的4種血清型DENV的重組EDⅢ作為免疫原，單獨(dú)或混合免疫BALB/c小鼠，制備了107株單抗。本研究中，我們對這些單抗針對不同血清型的結(jié)合特異性或交叉反應(yīng)性、中和活性進(jìn)行了詳細(xì)鑒定。首先，ELISA和IFA測定結(jié)果顯示，有94株單抗對重組EDⅢ或DENV感染的C6/36細(xì)胞的結(jié)合呈現(xiàn)特異性或交叉反應(yīng)性，包括42株針對單一血清型DENV的TS單抗、26株針對

12、2～3種血清型的sCR單抗及23株針對4種血清型的CR單抗，還有3株黃病毒交叉反應(yīng)單抗。但是，ELISA和IFA的鑒定結(jié)果并不完全相符，推測96孔板上包被的重組EDⅢ蛋白的構(gòu)象與感染C6/36細(xì)胞的登革病毒表面E蛋白的構(gòu)象的差異可能造成了這種不一致。
　　 隨后，我們借助已建立的ELISPOT-MNT微中和試驗(yàn)對以上單抗進(jìn)行體外保護(hù)性測定。根據(jù)單抗對病毒的50％抑制濃度（50％ inhibition concentration，

13、IC50）的大小，將單抗分為三類:強(qiáng)（IC50≤1μg/ml）、中等（1μg/ml＜IC50≤50μg/ml）、弱或無中和活性（IC50＞50μg/ml）。DENV-1 TS單抗（17株）、DENV-4 TS單抗（14株）對相應(yīng)的血清型病毒顯示出強(qiáng)、中、無的復(fù)雜中和活性;DENV-2 TS單抗（7株）對DENV-2均無中和活性;DENV-3 TS單抗（3株）對DENV-3均顯強(qiáng)中和活性。sCR單抗（26株）與CR單抗（23株）的中和活性

14、譜均較復(fù)雜，即單抗對不同血清型DENV出現(xiàn)強(qiáng)、中或無中和活性。還有3株黃病毒交叉反應(yīng)單抗均無中和活性。以上結(jié)果表明，單抗的結(jié)合特性與中和活性并不平行，即結(jié)合特異性相似的單抗可能顯示出不同的中和活性譜，我們分析以上差異可能是由于單抗對孤立的重組EDⅢ蛋白與天然病毒粒子表面展示的E蛋白的識別有差異。以上研究明確了眾多EDⅢ免疫單抗的結(jié)合能力和體外中和能力，為后續(xù)DENV EDⅢ單抗的抗原性位點(diǎn)鑒定、深入的結(jié)構(gòu)研究和全面的功能測定奠定了良好的

15、基礎(chǔ)。
　　 第二部分登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)單克隆抗體的表位鑒定
　　 DENV的EDⅢ區(qū)被認(rèn)為是研究亞單位疫苗有前景的抗原性區(qū)域。但是，EDⅢ上的抗原性位點(diǎn)及其與EDⅢ免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生單抗的體外保護(hù)作用的關(guān)系還沒有完全研究清楚。由此，本研究在94株單抗的結(jié)合特性及中和活性鑒定基礎(chǔ)上，對其抗原性位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的鑒定。
　　 首先，我們對94株單抗進(jìn)行合成重疊多肽掃描分析，發(fā)現(xiàn)12株單抗（2株DENV-2 TS

16、單抗、5株sCR單抗、1株CR單抗和2株黃病毒交叉反應(yīng)單抗）分別特異性地識別幾個(gè)不同的線性表位，但這12株單抗均無中和活性。相比之下，23株CR單抗中有15株（約占2/3）特異性地識別相同的aa310-319序列，進(jìn)一步的序列比對和殘基替換證實(shí)aa309-320表位是各血清型DENV間高度保守且免疫優(yōu)勢的復(fù)合體表位。
　　 值得注意的是，15株CR單抗與4個(gè)血清型DENV的重組EDⅢ或感染的C6/36細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)交叉反應(yīng)，但是，

17、它們對4個(gè)型DENV具有復(fù)雜的中和活性譜，大多數(shù)只顯示弱或中等中和活性。如何解釋這些單抗的結(jié)合交叉反應(yīng)性與中和能力的差異呢？我們繼續(xù)采用位點(diǎn)定向突變和酵母表面展示分析，發(fā)現(xiàn)ABloop上的Q316和H317是該表位的關(guān)鍵殘基;而且，三維建模分析表明，該表位在EDⅢ表面充分暴露，但在E蛋白二聚體和三聚體表面的可及性差，特別是在成熟病毒粒子表面可及性更差?？梢哉J(rèn)為，重組EDⅢ作為免疫原可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對在病毒粒子表面不暴露的單抗，因此這些單抗的

18、中和活性較弱。通過研究，我們合理地解釋了定位至EDⅢ AB loop的弱中和活性的交叉反應(yīng)單抗與重組EDⅢ免疫方式的關(guān)系，加深了對EDⅢ亞單位疫苗免疫策略的認(rèn)識，為后續(xù)改進(jìn)基于EDⅢ的疫苗免疫方案提供了依據(jù)。
　　 第三部分建立簡易、高通量的方法評價(jià)登革病毒抗體的功能
　　 開發(fā)登革疫苗需要盡可能減少潛在的ADE風(fēng)險(xiǎn)，從而要求針對DENV的4個(gè)血清型獲得均衡的保護(hù)性抗體反應(yīng)。在缺乏合適的登革疾病動(dòng)物模型的情況下，有必要開

19、發(fā)簡單、可靠且高通量的方法用于評價(jià)登革熱疾病的風(fēng)險(xiǎn)和疫苗的安全性。
　　 在本部分研究中，我們采用表達(dá)Fcγ受體的K562細(xì)胞株和已知具有增強(qiáng)活性的單抗，創(chuàng)新性地建立了通過“NS1抗原捕獲ELISA”檢測培養(yǎng)上清中NS1抗原的簡單高通量的登革抗體的ADE檢測方法（ELISA-ADE方法）。為評價(jià)該方法，我們同時(shí)采用2種方法（即新建立的NS1抗原定量方法和傳統(tǒng)的病毒滴度測定方法）檢測抗體的ADE活性。發(fā)現(xiàn)兩種方法的動(dòng)力學(xué)相當(dāng)，線性

20、相關(guān)分析證明，這2種方法具有很好的一致性(R=0.938，P=0.000)。隨后，我們還采用同為96孔板檢測和讀板的ELISA-ADE法和已經(jīng)建立的ELISPOT-MNT微中和試驗(yàn)評價(jià)2株黃病毒交叉反應(yīng)鼠單抗（4G2和2A10G6）和4份DENV-1感染患者的恢復(fù)期血清的增強(qiáng)活性和中和抗體活性。結(jié)果表明，新方法可獲得特征性的劑量反應(yīng)ADE圖譜，而且增強(qiáng)效應(yīng)發(fā)生在亞中和濃度，ADE效應(yīng)與經(jīng)ELISPOT-MNT測定獲得的中和效應(yīng)具有合理的

21、相互關(guān)系。
　　 本研究新建立的簡單高通量的ELISA-ADE法和已建立ELISPOT-MNT檢測方法對DENV的增強(qiáng)和中和抗體活性的功能性評價(jià)非常有價(jià)值。它們能在大規(guī)模研究中進(jìn)行DENV疫苗的安全性和有效性的評價(jià)，同時(shí)加速闡明疫苗免疫和登革疾病進(jìn)展過程中的疾病風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)機(jī)制。
　　 小結(jié):
　　 通過以上三個(gè)部分的研究，本課題在以下三個(gè)方面取得研究成果和創(chuàng)新:
　　 一、本研究詳細(xì)通過詳細(xì)鑒定，明確了重

22、組EDⅢ免疫制備的107株單抗中的94株針對不同血清型的結(jié)合特異性及交叉反應(yīng)性。隨后，我們借助已建立的ELISPOT-MNT微中和試驗(yàn)對以上單抗進(jìn)行體外保護(hù)性測定。42株DENV TS單抗中，有約一半對單一血清型DENV顯示較強(qiáng)的中和活性，26株sCR單抗中約1/3及23株CR單抗中約2/3對不同血清型DENV表現(xiàn)出強(qiáng)、中等或弱的復(fù)雜活性譜。我們通過重組EDⅢ蛋白與天然病毒粒子表面EDⅢ蛋白的構(gòu)象性差異，合理地解釋了單抗的結(jié)合能力與體外

23、中和能力方面的不一致。通過以上研究，我們獲得了有價(jià)值的強(qiáng)中和活性單抗（如本實(shí)驗(yàn)室其它研究者進(jìn)行的3E31、2D73等單抗的晶體結(jié)構(gòu)與功能研究），為后續(xù)EDⅢ單抗的抗原性位點(diǎn)鑒定、深入的結(jié)構(gòu)研究、全面的功能測定和治療性單抗的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 二、本部分研究在以上研究定基礎(chǔ)上，對94單抗的抗原性位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的鑒定。通過合成重疊多肽掃描分析、序列比對、氨基酸替換分析等，我們發(fā)現(xiàn)23株CR單抗中有15株（約占2/3）特異性地

24、識別相同的高度保守且免疫優(yōu)勢的DENV復(fù)合體表位（aa310-319序列），這是我們首次發(fā)現(xiàn)CR單抗識別這一表位具有免疫優(yōu)勢。我們繼續(xù)采用位點(diǎn)定向突變和酵母表面展示分析，發(fā)現(xiàn)該表位的關(guān)鍵殘基定位于AB loop上的Q316和H317。結(jié)合三維建模分析，我們認(rèn)為，重組EDⅢ作為免疫原可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對在病毒粒子表面表位不暴露的單抗，這些單抗對EDⅢ的結(jié)合能力強(qiáng)但中和活性較弱，合理地解釋了定位至ABloop弱中和活性的交叉反應(yīng)單抗與重組EDⅢ免

25、疫方式的關(guān)系，加深了對EDⅢ亞單位疫苗免疫策略的認(rèn)識，為后續(xù)改進(jìn)基于EDⅢ的疫苗免疫方案提供了依據(jù)。
　　 三、在本部分研究中，我們用表達(dá)Fcγ受體的K562細(xì)胞株和已知具有增強(qiáng)活性的單抗，在國內(nèi)外首次創(chuàng)新性地建立了通過NS1抗原捕獲ELISA定量檢測培養(yǎng)上清中NS1抗原的ADE檢測方法（ELISA-ADE方法），可對登革抗體的增強(qiáng)活性進(jìn)行簡單、快速、高通量的檢測，同時(shí)避免了其它方法繁瑣、費(fèi)時(shí)的檢測程序及對復(fù)雜儀器的要求。我們首