kibra基因啟動(dòng)子表觀遺傳學(xué)修飾改變對(duì)乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是一種具有高異質(zhì)性的惡性腫瘤。常見乳腺癌包括LuminalA型乳腺癌、LuminalB型乳腺癌、Her2過表達(dá)乳腺癌和三陰性乳腺癌。原發(fā)乳腺癌一般不會(huì)引起患者死亡，浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的直接原因。已有的研究顯示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是造成惡性腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和耐藥的起始步驟。KIBRA蛋白，(kidney and brai

2、n protein)主要在腎和腦中表達(dá)的一類蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)中，也被稱為WWC1，在Hippo-Yap信號(hào)通路中扮演至關(guān)重要的角色，主要參與記憶的形成。近年有研究表明，KIBRA可以干擾永生化乳腺癌細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)，抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT。本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Notch3可以通過影響Kibra調(diào)節(jié)的Hippo-Yap信號(hào)通路抑制乳腺癌EMT。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在急慢性淋巴細(xì)胞白血病中kibra基因啟動(dòng)子的甲基化與患者不良預(yù)后有關(guān)。

3、r>　　本課題研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)在惡性行為較高的乳腺癌細(xì)胞系中Kibra表達(dá)顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)引起了我們極大的興趣，我們推測(cè)在不同乳腺癌細(xì)胞Kibra表達(dá)差異可能與其甲基化程度有關(guān)。眾所周知，甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)的調(diào)控方式之一，基因組 DNA的甲基化修飾主要靠 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）起作用，甲基化修飾的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變

4、，這些變化往往會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)譜改變，尤其是啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高的甲基化，是導(dǎo)致抑癌基因沉默表達(dá)的重要原因之一。但是，單純的CpG島、特別是幾個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化不足以抑制基因的表達(dá)。最新的研究顯示，多梳蛋白抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex2，PRC2）家族成員EZH2，一方面可以促進(jìn)組蛋白H3K27的二重和三重甲基化，另一方面通過招募DNMT1并增強(qiáng)其促甲基化的活性，兩者共同抑制基因表達(dá)。由此可見檢

5、測(cè)腫瘤相關(guān)基因，特別是抑癌基因的CpG島甲基化狀態(tài)對(duì)于研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及早期診斷具有重要意義。
　　本課題研究中，我們首先利用免疫印跡和熒光定量PCR的方法檢測(cè)了6種不同乳腺癌細(xì)胞系Kibra的蛋白和mRNA的表達(dá)水平；隨后利用甲基化預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)在kibra基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000bp處存在甲基化的CpG島；其次，我們使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（RG108和5-aza-dC）競爭性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，利用免疫印跡和

6、熒光定量PCR法檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用前后Kibra表達(dá)的變化；接下來我們?cè)O(shè)計(jì)并合成甲基化特異性的MSP引物，利用PCR法檢測(cè)6中不同乳腺癌細(xì)胞甲基化的狀態(tài)；隨后選取ER+的MCF-7細(xì)胞和ER-的MDA-MB-231細(xì)胞作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)BSP引物并利用PCR、“TA”克隆、測(cè)序和甲基化分析比較了兩種乳腺癌細(xì)胞系中甲基化的差異；我們也單獨(dú)選用ER-的MDA-MB-231細(xì)胞作為研究對(duì)象，分析了RG108處理組和DMSO對(duì)照組k

7、ibra基因甲基化的差異；為了說明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑作用的特異性，我們利用RG108處理聯(lián)合shRNA敲減Kibra展開實(shí)驗(yàn)，利用免疫印跡法檢測(cè)聯(lián)合處理后Kibra及相關(guān)分子的蛋白表達(dá)。用CCK-8、克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、TUNEL等實(shí)驗(yàn)方法分別研究Kibra高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響；通過染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）的方法探究了kibra基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的分子機(jī)制；最后，我們以人體

8、乳腺癌組織樣本為研究對(duì)象，比較了三陰性乳腺癌和Luminal亞型乳腺癌組織中kibra基因甲基化的差異，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩種類型乳腺癌組織中Kibra的表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　免疫印跡和熒光定量PCR結(jié)果顯示，Kibra表達(dá)隨著乳腺癌細(xì)胞惡性行為的增強(qiáng)而呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。隨后我們分別使用20μM、100μM、500μM的RG108作用MDA-MB-231細(xì)胞7d，500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/

9、ml的5-aza-dC作用MDA-MB-231細(xì)胞5d，免疫印跡顯示隨著抑制劑濃度的升高，Kibra表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性上調(diào)，其他相關(guān)分子也呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。甲基化特異性的MSP引物PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示在不同類型乳腺癌細(xì)胞的kibra啟動(dòng)子區(qū)均存在部分甲基化，當(dāng)使用100μM RG108作用細(xì)胞7d，各細(xì)胞的甲基化水平明顯下調(diào)或丟失。利用甲基化特異性的BSP測(cè)序引物分析顯示三陰性MDA-MB-231細(xì)胞kibra基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于L

10、uminal亞型乳腺癌細(xì)胞，RG108處理組與DMSO對(duì)照組相比，kibra基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低。單獨(dú)100μM RG108處理，隨著Kibra表達(dá)上調(diào)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，侵襲，浸潤和轉(zhuǎn)移能力減弱，凋亡增強(qiáng)；隨著100μM RG108處理聯(lián)合shRNA敲減Kibra，KIBRA表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞各種功能部分被恢復(fù)，凋亡也隨之減弱。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞中kibra基因啟動(dòng)子CpG島存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，H

11、3K27me3、EZH2和SUZ12的結(jié)合位點(diǎn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控基因組DNA甲基化，PRC2復(fù)合物調(diào)控組蛋白H3K27三甲基化，二者共同調(diào)控kibra基因甲基化，影響Kibra的表達(dá)。最后，乳腺癌組織樣本顯示了與細(xì)胞水平一致的研究結(jié)果，即在提取的16例乳腺癌組織標(biāo)本的基因組DNA中，測(cè)序結(jié)果分析顯示三陰性乳腺癌組織標(biāo)本kibra基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于Luminal亞型乳腺癌組織，P<0.0001為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；免疫組織化學(xué)結(jié)果

12、也顯示，在22例乳腺癌組織標(biāo)本中，Luminal亞型乳腺癌組織Kibra表達(dá)高于三陰性乳腺癌組織。Fisher精確檢驗(yàn)P=0.04<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　綜上所述，本研究得出的結(jié)論有以下三點(diǎn)：1）隨著乳腺癌惡性程度增加，Kibra的表達(dá)有部分下調(diào)或丟失；2）Kibra調(diào)控的Hippo-Yap信號(hào)通路可能與乳腺癌增生、浸潤、轉(zhuǎn)移和凋亡有關(guān)；3）kibra啟動(dòng)子上存在基因組DNA和組蛋白甲基化修飾，基因組DNA的甲基化修飾受D