p38MAPK信號對γ珠蛋白基因啟動子區(qū)域表觀遺傳修飾的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 1．藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達可有效治療β-地中海貧血
　　 γ-珠蛋白基因活化是治療β-地中海貧血的行之有效的方法之一，是用藥物誘導(dǎo)出生后已關(guān)閉的γ-珠蛋白基因重新開放并有效表達，改善α-和非α-珠蛋白鏈合成的不平衡，增加胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，Hb F，α2γ2)合成，以達到減少溶血，緩解貧血癥狀的目的。
　　 迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種藥物具有誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達和/

2、或促進Hb F合成的作用。但不少藥物存在著療效差、毒副作用大或體內(nèi)半衰期短等缺點，因此有必要開發(fā)和尋找安全高效的新藥物用于治療β-地中海貧血等血紅蛋白病。
　　 2．藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達的作用機制
　　 闡明藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達機制是開發(fā)和設(shè)計高效安全藥物的前提，然而目前對藥物如何調(diào)控γ-珠蛋白基因重新表達、進而增加Hb F合成的作用機制尚未完全清楚。不同藥物的作用機制不盡相同，目前已知的大體上可歸納為三種模

3、式：(1)通過改變基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，開放染色質(zhì)，促使γ-珠蛋白基因表達；(2)通過不同細胞信號通路來調(diào)控γ-珠蛋白基因表達；(3)通過改變紅系細胞分化動力學(xué)來使γ-珠蛋白基因延遲關(guān)閉，提高HbF合成。
　　 3．p38MAPK信號介導(dǎo)藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達的重要作用
　　 p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是主要的MAPK信號通路之一。自從

4、10多年前發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路介導(dǎo)藥物誘導(dǎo)Hb F合成以來，此信號在藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達的作用越來越受到重視。目前發(fā)現(xiàn)許多藥物如短鏈脂肪酸類、組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑、細胞毒性藥物、甚至DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methytransferase，DNMT)抑制劑等都可通過這一信號通路來發(fā)揮誘導(dǎo)作用。由于這些藥物在藥理學(xué)上有明顯的區(qū)別，但它們都能通過p38MAPK信號來介導(dǎo)γ-

5、珠蛋白基因表達，因此p38MAPK信號通路可能是作用機制中的重要環(huán)節(jié)。
　　 鑒于p38MAPK的重要作用，闡明p38MAPK信號介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達的機制對于揭示藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因的作用機制具有重要意義。但目前對p38MAPK信號如何介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達還不明了，比較明確的是p38MAPK可通過激活轉(zhuǎn)錄激活蛋白如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB

6、)、激活轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor2，ATF2）等來介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達。
　　 4．本課題組對p38MAPK信號調(diào)控γ-珠蛋白基因表達的前期研究工作
　　 本課題組先前對p38MAPK信號調(diào)控γ-珠蛋白基因表達進行了較為深入的研究：(1)構(gòu)建了穩(wěn)定表達高/低磷酸化p38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞模型用于研究。(2)首次發(fā)現(xiàn)除轉(zhuǎn)錄因子CREB和ATF2外，GATA-1活化

7、與p38MAPK信號介導(dǎo)的γ-珠蛋白基因表達有密切關(guān)系。(3)通過構(gòu)建siRNA敲低GATA-1的K562細胞進一步驗證了GATA-1在p38MAPK信號介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達中的作用。
　　 5．染色質(zhì)表觀遺傳修飾對γ-珠蛋白基因表達的影響
　　 基因表達調(diào)控不僅受轉(zhuǎn)錄因子的影響，還與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA及組蛋白表觀遺傳修飾的動態(tài)變化有關(guān)。近年發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)表觀遺傳修飾在生長發(fā)育過程中β-珠蛋白基因簇不同基因表達轉(zhuǎn)換的“開

8、”與“關(guān)”中起著關(guān)鍵作用。某些γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)藥物，如DNMT抑制劑、HDAC抑制劑、短鏈脂肪酸等，同時也是表觀遺傳修飾的誘導(dǎo)劑，可以通過DNA去甲基化、組蛋白乙?；瘉泶偈功?珠蛋白基因表達，但此方面的研究還比較少。
　　 6．研究假設(shè)：p38MAPK信號可能通過影響基因啟動子區(qū)域表觀遺傳修飾來調(diào)控γ-珠蛋白基因表達
　　 目前已有的研究只揭示了數(shù)個轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子如CREB、ATF2、GATA-1與p38MAPK信號介導(dǎo)

9、γ-珠蛋白基因表達有關(guān)，闡明p38MAPK對γ-珠蛋白基因的作用機制仍需更多的研究。目前已知p38MAPK信號激活可以活化CREB，而CREB的結(jié)合蛋白CBP和p300具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性，能直接引起組蛋白乙酰化。另外，丁酸鹽類藥物具有HDAC抑制活性，既可通過乙?；M蛋白、也可通過激活p38MAPK信號來誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達。那么p38MAPK信號對γ-珠蛋白基因啟動予區(qū)域的表觀遺傳修飾有何影響?我們假設(shè)p38MAPK信號除了

10、可以直接作用于轉(zhuǎn)錄因子外，尚可通過介導(dǎo)γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域表觀遺傳修飾的變化來調(diào)控γ-珠蛋白基因表達。有關(guān)p38MAPK與γ-珠蛋白基因啟動子組蛋白乙?；难芯繄蟮啦欢?，且尚有不同的意見，而p38MAPK信號對γ-珠蛋白基因啟動子組蛋白磷酸化、DNA甲基化的作用尚未見報道，這是本研究的創(chuàng)新性之所在。
　　 7．研究目的和意義：
　　 本研究利用丁酸鈉(sodium butyrate，NaB)誘導(dǎo)的高磷酸化p38MAP

11、K的K562細胞和穩(wěn)定表達高/低磷酸化p38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞模型，通過檢測不同磷酸化p38MAPK水平下γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；?、磷酸化和DNA甲基化的變化，探討p38MAPK信號對γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域表觀遺傳修飾的影響。研究成果將為揭示藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因作用機制提供新的科學(xué)證據(jù)，對于開發(fā)和設(shè)計新藥用于治療β-地中海貧血等血紅蛋白病具有指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。
　　 方法：
　　 1．細胞培養(yǎng)<

12、br>　　 本研究實驗對象為具有紅系分化潛能的人紅白血病K562細胞株和用于對照的不表達珠蛋白的人宮頸癌Hela細胞株。兩種細胞均用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2．表達不同磷酸化p38MAPK水平的K562細胞模型的建立
　　 2.1 NaB處理K562細胞模型的建立及分組用終濃度0.5mM的NaB處理K562細胞4

13、8h，建立NaB誘導(dǎo)的高磷酸化p38MAPK細胞[K562(NaB)]。用p38MAPK特異抑制劑SB203580(終濃度10μM)預(yù)處理1h后再用NaB處理48h的K562細胞來建立抑制劑處理細胞[K562(SB+NaB)]。用于空白對照的K562親本細胞(K562)。
　　 2.2穩(wěn)定表達高/低磷酸化p38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞的建立及分組本課題組先前已建立了穩(wěn)定表達高/低磷酸化p38MAPK的轉(zhuǎn)染K562細胞和用于對照

14、實驗的轉(zhuǎn)染空載體的K562細胞。細胞分組：
　　 (1)穩(wěn)定表達高磷酸化p38MAPK的轉(zhuǎn)染K562細胞(K562-MKK3-Glu);
　　 (2)穩(wěn)定表達低磷酸化p38MAPK的轉(zhuǎn)染K562細胞(K562-MKK3-Ala);
　　 (3)轉(zhuǎn)染空載體的K562細胞(K562-vector);
　　 (4)SB203580預(yù)處理1h的穩(wěn)定表達高磷酸化p38MAPK的轉(zhuǎn)染K562細胞[K562-MKK3-

15、Glu(SB)];
　　 (5)K562親本細胞（K562）。
　　 3．表達不同磷酸化p38MAPK水平的K562細胞模型的鑒定
　　 用RT-PCR方法檢測p38MAPK、Gγ-和Aγ-珠蛋白mRNA的相對水平；用western blot方法檢測總p38MAPK、磷酸化p38MAPK和Hb F水平。
　　 4．γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白乙酰化和/或磷酸化分析
　　 采用基于real tim

16、e PCR分析的染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)技術(shù)分別分析Gγ-、Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白H3和H4乙?；╝cetylated H3 and H4，acH3 and acH4）、組蛋白H3磷酸化/乙?；?phosphorylated/acetylated H3，ph/acH3)水平。
　　 5．γ-珠蛋白基因啟動子DNA甲基化分析
　　 采用基于亞硫酸氫

17、鹽處理的直接測序法分析γ-珠蛋白基因啟動子DNA甲基化水平。
　　 6．統(tǒng)計學(xué)方法
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示。多個樣本均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)。方差齊性檢驗如方差齊時多重比較采用LSD方法檢驗；如方差不齊時方差分析采用近似F檢驗Welch法，多重比較采用Dunnett's T3方法檢驗。檢驗水準為α=0.05。
　　 結(jié)果

18、：
　　 1．K562細胞模型的鑒定
　　 1.1不同K562細胞模型的p38MAPK基因表達水平無差異RT-PCR結(jié)果顯示，藥物處理的K562細胞和不同的K562轉(zhuǎn)染細胞的p38MAPK mRNA水平無顯著差別(F=2.420，P::=0.081)。
　　 1.2不同K562細胞模型的總p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平不同K562細胞模型的總p38MAPK水平無顯著差別（F=0.302，P=0.926）

19、。但各組間磷酸化p38MAPK水平差異有顯著性（F=8154.574，P--0.000），其中K562(NaB)和K562-MKK3-Glu細胞的磷酸化p38MAPK水平高于K562細胞，分別升高了4.2和4.3倍(P=0.000);經(jīng)SB203580預(yù)處理的K562(SB+NaB)和K562-MKK3-Glu(SB)細胞、表達低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala細胞的磷酸化p38MAPK水平與K562細胞無差別（P＞0.

20、05）。
　　 1.3不同K562細胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白mRNA水平 K562(NaB)和K562-MKK3-Glu細胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平均比K562細胞高約1.4倍（P::=0.000），而SB203580可降低這兩種細胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平。K562-MKK3-Ala細胞的Gγ-珠蛋白mRNA水平與和K562細胞無差別（P＞0.05）。除K562-MKK3-Ala細胞Aγ-珠蛋白mRNA水平低下外，其他

21、各組細胞的Aγ-珠蛋白mRNA水平無顯著差別(P＞0.05）。
　　 1.4不同K562細胞模型的Hb F水平 K562(NaB)和K562-MKK3-Glu細胞的Hb F水平均比K562細胞升高了約3.4倍(P=0.000)，同樣地，SB203580可降低這兩組細胞的Hb F水平。表達低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala細胞的Hb F水平比K562細胞顯著降低(P=0.000)，降低倍數(shù)約2.4倍。
　　

22、 2．Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域的acH3和acH4水平
　　 2.1各K562細胞組組內(nèi)Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域acH3或acH4水平高于陰性對照necdin基因各個K562細胞模型組內(nèi)Gγ-珠蛋白基因、Aγ-珠蛋白基因和necdin基因的acH3或acH4水平相互比較均有顯著差別(P＜0.05)。G-、Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域acH3或acH4水平均高于在K562細胞中表達沉默的necdin基因(P＜0.

23、05)。在珠蛋白基因不表達的Hela細胞，Gγ-、Aγ-珠蛋白和necdin三種基因的acH3或acH4水平相互比較無顯著差別（P＞0.05）。
　　 2.2 NaB可通過激活p38MAPK來提高K562細胞Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3、acH4水平NaB誘導(dǎo)的K562(NaB)細胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域acH3、acH4水平均高于K562細胞，其中Gγ-acH3和Gγ-acH4水平分別升高3.1倍和2

24、.6倍(P＜0.05)，Aγ-acH3和Aγ-acH4水平分別升高3.7倍和3.2倍(P＜0.05)。SB203580抑制試驗顯示K562(SB+NaB)細胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3、acH4水平降低，分別只有K562(NaB)細胞的48.7%和40.6%、41.8%和28.9%。
　　 2.3穩(wěn)定表達高磷酸化p38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)acH3、acH4水平升高穩(wěn)定表

25、達高磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Glu細胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域acH3和acH4水平分別比K562細胞升高3.1和2.1倍、4.2和3.2倍（P＜0.05）。而持續(xù)表達低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala細胞的Gγ-acH3和Gγ-acH4、Aγ-acH3和Aγ-acH4水平與K562細胞相比無明顯變化(P＞0.05）。SB203580預(yù)處理可降低K562-MKK3-Glu細胞的acH3、ac

26、H4水平(P＜0.05）。
　　 3．Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域的ph/acH3水平
　　 3.1各K562細胞組組內(nèi)研-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域ph/acH3水平比陰性對照necdin基因高各個K562細胞模型組內(nèi)Gγ-珠蛋白基因、Aγ-珠蛋白基因和necdin基因的ph/acH3水平相互比較均有顯著差別(P＜0.05)。G-、Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域ph/acH3水平均高于在K562細胞中表達沉默的ne

27、cdin基因(P＜0.05)。在珠蛋白基因不表達的Hela細胞，Gγ-、Aγ-珠蛋白和necdin三種基因的ph/acH3水平比較無顯著差別(P＞0.05）。
　　 3.2 NaB可通過激活p38MAPK來提高K562細胞Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)ph/acH3水平K562(NaB)細胞的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域ph/acH3水平分別比K562細胞升高2.9倍和3.2倍（P＜0.05）。SB203580抑制試驗顯

28、示K562(SB+NaB)細胞的Gγ-ph/acH3和Aγ-ph/acH4水平分別只有K562(NaB)細胞的39.5%和36.8%。
　　 3.3穩(wěn)定表達高磷酸化p38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞模型的Gγ-和Aγ-珠蛋白基因啟動子區(qū)ph/acH3水平升高穩(wěn)定表達高磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Glu細胞的Gγ-ph/acH3和Aγ-ph/acH4水平也比K562細胞高，升高幅度分別為2.7和2.8倍(P＜0.05)

29、。表達低磷酸化p38MAPK的K562-MKK3-Ala細胞的Gγ-和Aγ-ph/acH3與K562細胞相比無變化（P＞0.05）。SB203580抑制試驗顯示K562-MKK3-Glu(SB)細胞的Gγ-和Aγ-ph/acH3水平分別只達到K562-MKK3-Glu細胞的25.6%和14.4%。
　　 4．不同K562細胞模型的γ-珠蛋白基因啟動子DNA甲基化程度低下
　　 基于亞硫酸氫鹽處理的直接測序法分析DNA甲基

30、化實驗結(jié)果表明，不同K562細胞模型的γ-珠蛋白基因啟動子-350、-256、-162、-53、-50、+6、+17和+50CpG位點甲基化水平均低下，各組細胞中DNA甲基化檢出率為0～2.5%。而在珠蛋白基因不表達的Hela細胞，-256、-53和-50位的CpG位點甲基化率為100%，總檢出率為37.5%。
　　 結(jié)論：
　　 1．本實驗通過建立NaB誘導(dǎo)的高磷酸化p38MAPK的K562細胞和穩(wěn)定表達高/低磷酸化p

31、38MAPK的K562轉(zhuǎn)染細胞模型，進一步證實p38MAPK激活可以介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達，促進Hb F合成。
　　 2．建立了基于real time PCR分析的染色質(zhì)免疫共沉淀實驗方法用于檢測γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；土姿峄?。
　　 3．建立了基于亞硫酸氫鹽處理的直接測序法用于分析γ-珠蛋白基因啟動子DNA甲基化水平。
　　 4．證實p38MAPK激活可以升高γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白H3

32、、H4乙?；?，該作用可被p38MAPK特異性抑制劑SB203580所抑制，提示促使γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；莗38MAPK信號介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達的機制之一。
　　 5．首次證實p38MAPK信號活化可提高γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白H3磷酸化/乙?；?，SB203580可抑制此作用，提示p38MAPK信號也可通過使γ-珠蛋白基因啟動子區(qū)域組蛋白磷酸化來介導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達。
　　 6．首次探討p