Sox2在乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用分析.pdf

1、目的：研究Sox2蛋白在乳腺癌ZR7530細(xì)胞株中的細(xì)胞生物學(xué)行為，并通過(guò)尋找ZR7530中與SOX2相關(guān)的miRNA，進(jìn)一步探討乳腺癌惡性事件中可能涉及的分子機(jī)制。
　　方法：1、利用Western blotting從蛋白水平檢測(cè)Sox2的表達(dá)情況，以驗(yàn)證所構(gòu)建的ZR7530 Sox2沉默、過(guò)量表達(dá)及對(duì)照三個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞系；
　　2、采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察ZR7530細(xì)胞增殖及成瘤能力，通過(guò)損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞

2、的遷移能力；并進(jìn)一步皮下接種腫瘤細(xì)胞，每三天測(cè)量一次裸鼠腫瘤體積；此外，通過(guò)尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞，八周后處死裸鼠，取肺組織行HE染色，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；
　　3、應(yīng)用miRNA芯片(miRCURYLNA Expression Array(v.18.0))檢測(cè)與Sox2相關(guān)的差異表達(dá)miRNA，利用SAM軟件將變化倍數(shù)Sox2-KD/Scramble或pCDH-Sox2/Scramble≤0.5或≥2的視為差異表達(dá)miRNA，對(duì)

3、篩選出的差異表達(dá)miRNAs利用數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan、miRDB、PicTar、miRanda分析相應(yīng)的靶基因。
　　結(jié)果：1、與對(duì)照組相比，ZR7530 Sox2-KD細(xì)胞中Sox2蛋白表達(dá)水平明顯下降(P=0.0480)，ZR7530 pCDH-Sox2的Sox2蛋白表達(dá)量顯著提高(P=0.0296)。
　　2、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：72h開(kāi)始，pCDH-Sox2與S cramble相比細(xì)胞增殖能力提高，且差異具有

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0106,P＜0.05）；96h時(shí)，pCDH-Sox2與Scramble相比，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0021,P＜0.01）；而Sox2-KD增殖雖比Scramble略減，但直到96 h差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1179，P＜0.05）。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果：計(jì)數(shù)直徑φ0.5mm的克隆結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Sox2-KD組克隆數(shù)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0377,P＜0.05），而Sox2過(guò)量表

5、達(dá)的ZR7530細(xì)胞克隆數(shù)目雖有增加，但效果不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4401,P＜0.05）。損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比較，SOX2過(guò)量表達(dá)組24h前遷移不明顯，24h后細(xì)胞遷移開(kāi)始增多，48h時(shí)，與對(duì)照相比遷移能力提高（P=0.0379，P＜0.05）；SOX2沉默組細(xì)胞遷移較慢，但差異不顯著（P=0.9738，P＜0.05）。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果：接種ZR7530 pCDH-Sox2的裸鼠成瘤后腫瘤生長(zhǎng)迅速（P=0.005

6、7，P＜0.01），Sox2沉默組與對(duì)照相比，腫瘤生長(zhǎng)速度減慢（P=0.0220，P＜0.05）。腫瘤細(xì)胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)果：注射ZR7530 pCDH-Sox2的裸鼠肺組織鏡下可見(jiàn)大面積轉(zhuǎn)移灶（P=0.0055,P＜0.01），而注射ZR7530 Sox2-KD的裸鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶較少（P=0.3894,P＜0.05）。
　　3、根據(jù)miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果，將ZR7530 Sox2-KD、ZR7530 pCDH-Sox2分別與ZR753

7、0 Scramble相比，結(jié)果Sox2-KD與Scramble比較共篩選出91種差異表達(dá)miRNAs，其中49種miRNAs表達(dá)上調(diào)，42種表達(dá)下調(diào)；此外，pCDH-Sox2與Scramble比較共篩得251個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中136個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，115個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：1、驗(yàn)證了前期構(gòu)建的ZR7530 Scramble、Sox2-KD及pCDH-Sox2三個(gè)細(xì)胞系；
　　2、Sox2在體外可促進(jìn)乳腺