SRGN在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：乳腺癌目前是女性發(fā)病率最高、危害最嚴(yán)重的惡性腫瘤，每年全球大約有120萬(wàn)人被診斷為乳腺癌，約50萬(wàn)人死于乳腺癌，其乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移一直是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。因此，研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制是目前乳腺癌研究領(lǐng)域中的重要課題。
　　絲甘蛋白聚糖(Serglycin，SRGN)屬于小分子蛋白聚糖家族，由 SRGN基因編碼的核心蛋白和各種粘多糖（ GAG）組成。主要分布在細(xì)胞內(nèi)，也可以分泌和整合到細(xì)胞外基質(zhì)中。其核心蛋白由位于染色體1

2、0q22.1 SRGN基因編碼，長(zhǎng)158個(gè)氨基酸，分三個(gè)區(qū)域組成：信號(hào)肽、N端和C端，N端有兩個(gè)半胱氨酸殘基，C端有多個(gè)絲氨酸/甘氨酸重復(fù)區(qū)，主要與 GAG結(jié)合，其修飾核心蛋白的GAG鏈的類型和大小，對(duì)SRGN的生物學(xué)作用起著關(guān)鍵的作用。SRGN主要在人體正常血液系統(tǒng)各種細(xì)胞、一些腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有表達(dá)。有文獻(xiàn)表明SRGN的表達(dá)與一些腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是S RGN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的地位和意義以及作用規(guī)律遠(yuǎn)未得以

3、闡述和明確。
　　最近，本實(shí)驗(yàn)室采用低劑量遞增結(jié)合大劑量間歇誘導(dǎo)方法，建立了一株穩(wěn)定的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞株（MCF7/5Fu），發(fā)現(xiàn)該耐藥細(xì)胞株在獲得耐藥表型同時(shí)，也表現(xiàn)出EMT及侵襲轉(zhuǎn)移表型。進(jìn)一步通過(guò)耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)并驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞MCF7細(xì)胞相比，SRGN在MCF7/5Fu細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)20倍，同時(shí)伴有TGFβ2、Vimentin、CD44因子表達(dá)明顯上調(diào)及E-cadherin的下調(diào)，提示SRGN及

4、上述相關(guān)因子可能介導(dǎo)了MCF7/5Fu的耐藥和轉(zhuǎn)移。
　　在前期工作中，本課題組已證實(shí) SRGN參與乳腺癌多藥耐藥的作用機(jī)制。本項(xiàng)目擬在前期基礎(chǔ)上對(duì) SRGN在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制進(jìn)行研究，為識(shí)別和鑒定乳腺癌新的標(biāo)志物，闡述乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.RT-PCR、Western blot方法分別檢測(cè)不同分子分型乳腺癌細(xì)胞系SRGN的表達(dá)水平，ELISA方法檢測(cè)多組乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中

5、SRGN的含量。
　　2.構(gòu)建針對(duì)SRGN的干擾載體，包裝為重組慢病毒，感染S RGN表達(dá)較高的MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株MDA-MB-231-sh-SRGN及對(duì)照組細(xì)胞MDA-MB-231-control。同樣構(gòu)建過(guò)表達(dá)SRGN的過(guò)表達(dá)載體，感染SRGN表達(dá)較低的MCF7細(xì)胞，通過(guò)G418篩選，最后得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SRGN的細(xì)胞 MCF7-SRGN-LV及對(duì)照組細(xì)胞 MCF7-control，通過(guò)劃痕實(shí)

6、驗(yàn)和 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SRGN對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并通過(guò)Western blot檢測(cè)SRGN、TGFβ2、EMT相關(guān)分子Vimentin、E-cadherin以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP2、MMP9的表達(dá)。
　　3.采用不同濃度細(xì)胞因子TGFβ2處理體外培養(yǎng)的各乳腺癌細(xì)胞后RT-PCR、Western blot、ELISA檢測(cè)細(xì)胞中SRGN表達(dá)和含量變化；同時(shí)用不同濃度的TGFβ因子抑制劑SD208處理三陰型乳腺癌

7、細(xì)胞MDA-MB-231檢測(cè)SRGN表達(dá)量的變化。
　　4.構(gòu)建含SRGN啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因?qū)隡DA-MB-231細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度的TGFβ2及TGFβ抑制因子SD-208處理對(duì)SRGN啟動(dòng)子活性的影響。
　　5.通過(guò)生物信息學(xué)分析Smad3與SRGN啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合位點(diǎn)。
　　6.將Smad3表達(dá)載體與含S RGN啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)Smad3對(duì)S RGN轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)活性；同時(shí)

8、根據(jù)5個(gè)可能結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)5組PCR引物，利用CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證S mad3與S RGN啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域。
　　7.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在MDA-MB-231細(xì)胞中S RGN與TGFβ2的相互結(jié)合情況，ELISA檢測(cè)SRGN敲低表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞上清中TGFβ2的含量。
　　8.將敲低SRGN表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-sh-SRGN和過(guò)表達(dá)SRGN的細(xì)胞MCF7-SRGN-LV及其對(duì)照細(xì)胞分別經(jīng)皮下接種

9、裸鼠體內(nèi)，建立裸鼠移植瘤模型，觀察 SRGN對(duì)裸鼠成瘤的影響，待腫瘤形成后，觀察并測(cè)量體重、長(zhǎng)徑、短徑，同時(shí)計(jì)算腫瘤體積繪制增長(zhǎng)曲線圖，同時(shí)將上述的細(xì)胞分別經(jīng)裸鼠尾靜脈注射后解剖觀察肺轉(zhuǎn)移狀況以探討SRGN對(duì)乳腺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。
　　9.免疫組化檢測(cè)66例乳腺癌癌組織及12例對(duì)照組織中 SRGN、TGFβ2、MMP2、MMP9的表達(dá)，通過(guò)病例資料分析S RGN表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、分子分型的相關(guān)性及SRGN表達(dá)與TGFβ2、

10、MMP2、MMP9的相關(guān)性。
　　10.通ELISA檢測(cè)163例乳腺癌患者及38例正常人血清中SRGN的表達(dá)水平，通過(guò)病例資料分析SRGN表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、分子分型的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.SRGN在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、BT549中的表達(dá)明顯高于其它分子分型細(xì)胞如MCF7、T47D、BT474、SKBR3、MDA-MB-453等乳腺癌細(xì)胞。
　　2.SRGN敲低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MD

11、A-MB-231-sh-SRGN體外遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組細(xì)胞 MDA-MB-231-control（P=0.01），且 TGFβ2、MMP2、MMP9、Vimentin下調(diào)，而E-cadherin上調(diào)；過(guò)表達(dá)SRGN的MCF7-SRGN-LV細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力高于對(duì)照組細(xì)胞MCF7-contro l（P=0.015），且TGFβ2、MMP2、MMP9、Vimentin上調(diào)，而E-cadherin下調(diào)。
　　3.TGF

12、β2明顯促進(jìn) MDA-MB-231、BT549細(xì)胞即 TNBC型乳腺癌細(xì)胞中SRGN表達(dá)；TGFβ受體抑制劑SD208可明顯抑制這一表達(dá)。
　　4.TGFβ2可以顯著增強(qiáng)S RGN啟動(dòng)子的活性而上調(diào)S RGN的表達(dá)；而TGFβ2受體抑制劑SD-208可阻斷這一作用。
　　5.通過(guò)進(jìn)一步分析SRGN啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（-2000--+200），發(fā)現(xiàn)有5個(gè)Smad2/3結(jié)合位點(diǎn)（SBE：AGAC或者互補(bǔ)的GTCT序列），包括

13、-1686至-1682 bp、-1519至-1515 bp、-1329至-1325 bp、-745至-741 bp、+135至+139 bp等五個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)這五個(gè)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)五個(gè) CHIP實(shí)驗(yàn)的引物 Smad3-1、Smad3-2、Smad3-3、Smad3-4、Smad3-5。
　　6.293T細(xì)胞中熒光素酶活性檢測(cè)顯示S mad3可增強(qiáng)S RGN啟動(dòng)子的活性，結(jié)合CHIP實(shí)驗(yàn)顯示Smad3可通過(guò)SRGN啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)

14、S mad3-1、S mad3-4、Smad3-5調(diào)控SRGN的轉(zhuǎn)錄。
　　7.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示SRGN可與TGFβ2結(jié)合，當(dāng)SRGN表達(dá)被敲低后細(xì)胞上清中的TGFβ2含量隨之降低。
　　8.從繪制的腫瘤生長(zhǎng)曲線圖和腫瘤的重量圖中，我們可以看出體外SRGN敲低的MDA-MB-231細(xì)胞的成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力均下降（P<0.05）。
　　9.SRGN與TGFβ2在乳腺癌組織中的表達(dá)高于遠(yuǎn)端癌旁組織，S RGN在乳腺癌組織

15、中表達(dá)與乳腺癌的分子分型、轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），而與年齡、腫瘤的大小無(wú)關(guān)（P>0.05）。TGFβ2在乳腺癌組織中表達(dá)與乳腺癌的分型有關(guān)（P<0.05），而與年齡、轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小無(wú)關(guān)（P>0.05）。且S RGN與TGFβ2、MMP2、MMP9的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系。
　　10.SRGN在乳腺癌患者血清中表達(dá)高于正常人血清中（P<0.05），且與乳腺癌的分子分型、轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. SR