表觀遺傳學(xué)修飾在婦科腫瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)修飾(Epigenetics)是指在不改變DNA序列的前提下，細(xì)胞內(nèi)其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的基因表達(dá)或細(xì)胞表型變化，這種改變?cè)谂咛グl(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定遺傳且具有可逆潛能。表觀遺傳學(xué)修飾主要包括兩大類，一類是基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控，主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、基因組印記、基因沉默、核仁顯性及休眠轉(zhuǎn)座子激活等，另一類為基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，主要包括基因組中非編碼RNA、MicroRNA、反義RNA、內(nèi)含

2、子及核糖開關(guān)等。與經(jīng)典遺傳學(xué)以研究基因序列影響生物學(xué)功能為核心相比，表觀遺傳學(xué)主要研究這些“表觀遺傳現(xiàn)象”建立和維持的機(jī)制，作為經(jīng)典遺傳學(xué)的補(bǔ)充，表觀遺傳學(xué)讓我們更全面的理解基因調(diào)節(jié)的機(jī)制。近年來研究已證實(shí)表觀遺傳學(xué)修飾在干細(xì)胞分化，早期胚胎發(fā)育及多種疾?。[瘤、自身免疫疾病及代謝性疾病等）的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用;特別是在腫瘤研究領(lǐng)域，表觀遺傳學(xué)修飾與原癌基因激活、抑癌基因失活、DNA損傷修復(fù)缺陷及腫瘤干細(xì)胞分化等密切相關(guān)。

3、>　　針對(duì)腫瘤表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究的最終目的是為了應(yīng)用于臨床診斷及預(yù)防治療。DNA甲基化和MicroRNA在診斷方面的研究已經(jīng)趨于成熟，F(xiàn)ujiwara等研究表明5個(gè)基因血清游離DNA甲基化譜在診斷早期肺癌方面特異性和陽性預(yù)測值分別為85％和75％，同樣眾多研究表明MicroRNA表達(dá)譜可應(yīng)用于乳腺癌的病理分型（如雌孕激素受體狀態(tài)、腫瘤分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及Her2狀態(tài)等）。本研究主要研究DNA甲基化及MicroRNA表達(dá)譜在早期上皮性卵巢癌及

4、子宮平滑肌腫瘤診斷分類中的應(yīng)用。
　　第一部分:多重巢式甲基化特異性PCR在早期上皮性卵巢癌診斷中的應(yīng)用研究
　　背景和目的
　　卵巢癌發(fā)病率位居女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌癥死亡女性患者的3％，其中90％以上為上皮性卵巢癌。卵巢癌發(fā)病隱匿，臨床確診時(shí)約85％患者疾病已為晚期（FIGOⅡ-Ⅳ期），5年生存率僅為30～44％，而早期卵巢癌（FIGOⅠ期）患者5年生存率高達(dá)93％。因此，除積極尋找

5、新的有效的治療方式外，探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，研發(fā)新型卵巢癌早期診斷技術(shù)迫在眉睫。
　　目前尚無簡便有效的、可常規(guī)應(yīng)用的卵巢癌早期診斷方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標(biāo)志物，但僅有50％的Ⅰ期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病（如子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢纖維瘤、盆腔炎性疾病及某些其他惡性腫瘤等）亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特異性較差，卵巢癌陽性預(yù)測值僅有10％～35％?？傮w而言，對(duì)于血清CA125檢測、

6、經(jīng)陰道超聲探查等傳統(tǒng)的診斷方法單一或聯(lián)合應(yīng)用，目前均無證據(jù)顯示可降低人群的卵巢癌發(fā)病率和（或）病死率，其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽性率均過高，敏感性和特異性達(dá)不到臨床需要。
　　DNA甲基化，即在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上生成5-甲基胞嘧啶，是重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。DNA啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制，在某些情況下可能是唯一的機(jī)制，在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。作為癌癥發(fā)生的早

7、期事件，DNA異常甲基化檢測可以在患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)或者影像學(xué)證據(jù)之前做到分子診斷，為癌癥早期診斷提供新的途徑?，F(xiàn)已證實(shí)腫瘤患者中血清游離DNA含量明顯升高，其來源主要有2種機(jī)制:1、增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞持續(xù)釋放DNA進(jìn)入血液循環(huán);2、腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡或直接入血裂解使血清游離DNA含量增高。血清游離DNA具有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學(xué)改變（如啟動(dòng)子區(qū)高甲基化、基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性缺失等），可間接反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況。使

8、用血清游離DNA甲基化檢測在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等已被證實(shí)可行，因此卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測，是一種可行的具有臨床實(shí)用價(jià)值的卵巢癌早期診斷技術(shù)。針對(duì)血清游離DNA微量，甲基化特異性PCR敏感性不足的特點(diǎn)，課題組將多重PCR、巢式PCR與甲基化特異性PCR相結(jié)合，開發(fā)出全新的多重巢式甲基化特異性PCR(Multiplex-MSP)檢測方法，已滿足血清微量腫瘤游離DNA樣本多基因甲基化檢測需要。
　　材料和方

9、法
　　1.上皮性卵巢癌特異性甲基化基因的篩選。
　　2.臨床卵巢腫瘤及正常對(duì)照病人血清及組織樣本的收集。
　　3.引物的設(shè)計(jì)合成及多重巢式甲基化特異性PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。
　　4.多重巢式甲基化特異性PCR檢測血清及組織樣本甲基化水平。
　　5.卵巢癌血清與組織甲基化譜對(duì)照研究。
　　6.回顧性分析評(píng)估多重巢式甲基化特異性PCR檢測在上皮性卵巢癌早期診斷中的意義。
　　7.雙盲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證

10、多重巢式甲基化特異性PCR檢測在上皮性卵巢癌早期診斷中的作用。
　　結(jié)果
　　1.通過Pubmed檢索篩選出7個(gè)與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的高頻甲基化基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML。
　　2.將多重PCR、巢式PCR與甲基化特異性PCR相結(jié)合，開發(fā)出全新的多重巢式甲基化特異性PCR檢測方法。
　　3.應(yīng)用多重巢式甲基化特異性PCR對(duì)20例卵巢癌血清及配對(duì)組織進(jìn)行

11、檢測，證實(shí)血清游離DNA甲基化譜完全包含于腫瘤組織DNA甲基化譜。
　　4.應(yīng)用多重巢式甲基化特異性PCR回顧140例卵巢腫瘤及正常女性血清標(biāo)本，結(jié)果證實(shí)該方法的特異性為90.57％，敏感性為89.66％;特別是在41例早期卵巢癌（Ⅰ期）檢測方面，特異性為90.57％，敏感性為85.37％，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)CA125檢測（P＜0.05）。
　　5.雙盲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)多重巢式甲基化特異性PCR檢測早期上皮性卵巢癌的靈敏性為83.3

12、3％，特異性為82.76％。
　　結(jié)論
　　1.血清游離DNA甲基化可以準(zhǔn)確反映腫瘤組織DNA甲基化狀態(tài)，可以作為腫瘤早期診斷的標(biāo)記物。
　　2.本研究所開發(fā)的血清游離DNA多重巢式甲基化特異性PCR是高效準(zhǔn)確檢測血清游離DNA甲基化狀態(tài)的新方法。
　　3.多重巢式甲基化特異性PCR檢測方法有望應(yīng)用于上皮性卵巢癌的早期診斷。
　　關(guān)鍵詞:上皮性卵巢癌;Multiplex-MSP;血清游離DNA;早期診斷

13、r>　　第二部分:MicroRNA表達(dá)譜及DNA甲基化在子宮平滑肌腫瘤診斷分類中的應(yīng)用研究
　　背景和目的
　　臨床上，常見的子宮平滑肌腫瘤主要包括良性子宮平滑肌瘤和惡性子宮平滑肌肉瘤，它們的分類主要基于以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞異型性、有絲分裂相、腫瘤細(xì)胞壞死，典型的子宮平滑肌瘤形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為無細(xì)胞異型性，小于10MF/10HPF的有絲分裂相，可能會(huì)表現(xiàn)出玻璃樣壞死（如缺血性），但缺乏典型的凝固性腫瘤細(xì)胞壞死;相反，惡性子宮平

14、滑肌肉瘤至少具備以下3個(gè)特征中的2個(gè)，明顯的細(xì)胞異型性，大于10MF/10HPF的有絲分裂相及典型的凝固性腫瘤細(xì)胞壞死。
　　在典型的子宮平滑肌瘤和子宮平滑肌肉瘤之間，存在幾大類中間類型的子宮平滑肌腫瘤，它們表現(xiàn)一些但不是所有的惡性腫瘤的特征，主要包括以下幾大類:不典型性、惡性潛能未定型、有絲分裂活躍型、富于細(xì)胞性等，它們的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)1994年發(fā)表的Bell準(zhǔn)則及2003年WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)。除典型的良性子宮平滑肌瘤外，其他

15、類型的子宮平滑肌腫瘤發(fā)病率很低，診斷也存在一定的分歧，對(duì)它們的研究大部分集中于臨床及病理階段，其分子生物學(xué)研究較少。
　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，1、子宮平滑肌肉瘤為突然發(fā)生（denovo），沒有癌前病變;2、不典型性子宮平滑肌瘤是普通子宮平滑肌瘤的一個(gè)變種，屬于良性病變。但隨著目前對(duì)各類型子宮平滑肌腫瘤的分子生物學(xué)研究進(jìn)展，這兩個(gè)觀點(diǎn)受到了挑戰(zhàn)。臨床上對(duì)不典型性子宮平滑肌瘤沒有明確的診療指南，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這類腫瘤雖然具有高治愈率和低復(fù)

16、發(fā)率的特點(diǎn)，但也有病例(3/18)死于這類疾病，但與子宮肉瘤相比有更長的潛伏期（＞6年vs2.1年），在臨床實(shí)踐中，我們也看到極個(gè)別的不典型性子宮平滑肌瘤在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)展成為子宮肉瘤的情況;另外不典型性子宮平滑肌瘤部分存在染色體1p缺失，與典型的子宮肌瘤相比與平滑肌肉瘤更為相似。在前期研究中，課題組對(duì)167例不同類型的子宮平滑肌腫瘤從組織形態(tài)學(xué)、基因突變、染色體變異及免疫組化角度進(jìn)行了整體分析。研究顯示，MED12基因突變?cè)诓坏湫托宰訉m平

17、滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中的突變率均低于15％(P＞0.05)，普通子宮平滑肌瘤突變率為75％;P53基因突變?cè)诓坏湫托宰訉m平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中的突變率分別為12％和24％(P＞0.05)，而普通子宮平滑肌瘤未發(fā)現(xiàn)突變;PTEN缺失在不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤中也具有相似的缺失頻率（P＞0.05）。課題組進(jìn)一步挑選與子宮平滑肌肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)行免疫組化染色，聚類分析顯示不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤具有

18、相似的蛋白表達(dá)譜。基于以上研究基礎(chǔ)，課題組假設(shè)不典型性子宮肌瘤可能代表有能力演變?yōu)樽訉m平滑肌肉瘤的中間形式，可能是其癌前病變。
　　本研究著重從MicroRAN表達(dá)譜、DNA甲基化角度對(duì)子宮平滑肌腫瘤進(jìn)行研究，以尋求不典型性子宮肌瘤可能是子宮平滑肌肉瘤的癌前病變這一假說的更多證據(jù)。
　　材料和方法
　　1.收集美國NorthwesternUniversity,Northwesternmemorialhospital及山

19、東大學(xué)齊魯醫(yī)院1993～2013年185例不同類型的子宮平滑肌腫瘤（包括38例子宮平滑肌肉瘤、42例不典型性子宮平滑肌瘤、18例惡性潛能未定的子宮平滑肌瘤、22例富于細(xì)胞性子宮平滑肌瘤、7例有絲分裂活躍型子宮平滑肌瘤及58例普通子宮平滑肌瘤），所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料。
　　2.提取組織形態(tài)學(xué)最典型的子宮平滑肌肉瘤，不典型性子宮平滑肌瘤，惡性潛能未定的子宮平滑肌瘤，富于細(xì)胞性子宮平滑肌瘤，普通子宮平滑肌瘤及正常子宮肌

20、層各8例RNA，利用FirePlexTM平臺(tái)行miRNA表達(dá)譜分析。
　　3.提取18例普通子宮平滑肌瘤及配對(duì)子宮肌層新鮮組織DNA，利用InfiniumHumanMethylation27KBeadChip行全基因組甲基化譜分析。
　　4.提取30例子宮平滑肌肉瘤，25例不典型性子宮平滑肌瘤，12例普通子宮平滑肌瘤及6例正常子宮肌層DNA，利用SequenomMassArray甲基化檢測平臺(tái)對(duì)候選基因（KLF11、DLEC

21、1及RUNX3）進(jìn)行啟動(dòng)子CpG島甲基化分析。
　　結(jié)果
　　1.非監(jiān)督聚類分析及馬氏距離分析均顯示不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表達(dá)譜。
　　2.InfiniumHumanMethylation27KBeadChip篩選出子宮平滑肌瘤相對(duì)正常子宮肌層顯著高甲基化的基因KLF11及DLEC1(P＜0.001)。
　　3.不典型性子宮平滑肌瘤中KLF11、DLEC1及RUNX3甲基化譜

22、與子宮平滑肌肉瘤相近(P＞0.05)，而與子宮平滑肌瘤差異顯著(P＜0.05)。
　　4.結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，對(duì)全部類型的子宮平滑肌腫瘤進(jìn)行主成成分3D距離分析，發(fā)現(xiàn)不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤距離最為接近。
　　結(jié)論
　　1.相對(duì)于普通子宮平滑肌瘤，不典型性子宮平滑肌瘤與子宮平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表達(dá)譜及甲基化譜，從表觀遺傳學(xué)角度提示不典型子宮平滑肌瘤可能為子宮平滑肌肉瘤的癌前病變。