Dact2在肝癌中的表觀遺傳學(xué)變化及功能研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。肝癌的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，表現(xiàn)遺傳學(xué)改變調(diào)控的wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因失活在肝癌發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。Dact（Homo sapiens dapper，antagoni st of β-catenin）是wnt/β-catenin信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)基因家族。有研究表明Dact1和Dact3的表達(dá)分別受DNA甲基化

2、和組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)調(diào)控，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。但Dact2與腫瘤的關(guān)系研究文獻(xiàn)報(bào)道很少，在肝癌中的表現(xiàn)遺傳學(xué)變化及功能尚不清楚。
　　 目的：
　　 1.檢測Dact2在永生化肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及甲基化改變。
　　 2.檢測Dact2在正常肝組織、癌旁組織及不同分化程度肝癌組織中的表達(dá)及意義。
　　 3.檢測Dact2在肝癌組織中的甲基化改變。
　　 4.探討肝癌組織中DNA甲基

3、化與Dact2表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 5.檢測Dact2對肝癌細(xì)胞生長的影響。
　　 6.探討Dact2抑制肝癌細(xì)胞生長的可能機(jī)制。
　　 方法
　　 1.RT-PCR和western blot檢測細(xì)胞系中Dact2在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理前后mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 2.甲基化特異性PCR（methylation specific PcR，MSP）檢測細(xì)胞系和組織標(biāo)本DNA中D

4、act2甲基化情況。
　　 3.免疫組織化學(xué)方法檢測Dact2在正常肝組織、癌旁組織及不同分化程度肝癌組織中的表達(dá)分布。
　　 4.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Dact2真核表達(dá)載體，流式細(xì)胞分選結(jié)合G418篩選瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Dact2的細(xì)胞。
　　 5.克隆形成實(shí)驗(yàn)及BrdU摻入標(biāo)記方法分析Dact2對細(xì)胞生長的影響
　　 6.Hoechst 33258染色分析Dact2對細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　

5、 1.Dact2在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及甲基化改變本課題選用5株肝癌細(xì)胞系：HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182、PLC-PRF-5和一株永生化的肝細(xì)胞系Lo.2。在mRNA水平，Dact2在SNU449細(xì)胞系中無表達(dá)，在HepG2、SNU182、SMMC7721表達(dá)較弱，在Lo.2和PLC-PRF-5細(xì)胞中表達(dá)正常；5-aza-dc處理后，HepG2、SMMC7721、SNU182細(xì)胞中Dact2較未處理時(shí)表達(dá)上調(diào)，

6、而L0.2、PLC-PRF-5和SNU449中Dact2無改變。選取HcoG2和SNU182兩株細(xì)胞系檢測Dact2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示Dact2蛋白在5-aza-dc處理后上調(diào)，與mRNA水平的表達(dá)改變一致。MSP檢測結(jié)果顯示10.2和PLC-PRF-5中Dact2為非甲基化，HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182細(xì)胞系中存在甲基化改變，其中，SNU182、SNU449和SMMC7721細(xì)胞中同時(shí)有甲基化和非甲基化條

7、帶。Dact2啟動子甲基化改變與基因表達(dá)呈對應(yīng)關(guān)系。
　　 2.Dact2在肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)及甲基化情況在表達(dá)部位上，Dact2在正常肝組織、癌旁組織和癌組織中表達(dá)均在細(xì)胞漿；在表達(dá)強(qiáng)度上，肝癌組織內(nèi)Dact2表達(dá)較癌旁明顯減低，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；在高分化和中分化肝癌組織中Dact2的表達(dá)顯著高于低分化組（P<0.05），而與患者的年齡、姓別、腫瘤大小及HBV相關(guān)性肝癌無顯著相關(guān)。38例肝癌組織中的Da

8、ct2甲基化率為60.5％；在16例表達(dá)下調(diào)的肝癌標(biāo)本中檢測到Dact2甲基化的有11例（68.75％）。
　　 3.恢復(fù)Dact2表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生長的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示恢復(fù)Dact2表達(dá)后hepG2細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯少于對照轉(zhuǎn)染的空載體，Dact2對細(xì)胞長期生長抑制作用大于空載體的2倍。Brdu摻入標(biāo)記后轉(zhuǎn)染Dact2的陽性細(xì)胞為39.63％，明顯少于空質(zhì)粒組48.32％，兩組比較有顯著差異（P<0.05）。
　　

9、 4.Hoechst 33258染色分析Dact2對細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染Dact2后HcpG2的凋亡率為10.9％，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的凋亡率4.9％；SNU449細(xì)胞轉(zhuǎn)染Dact2后細(xì)胞凋亡率為12.30％，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的凋亡率12.10％，提示Dact2對細(xì)胞凋亡無明顯影響。結(jié)論本課題檢測了肝癌中Dact2的表達(dá)及DNA甲基化改變，5-aza-dc處理細(xì)胞系能恢復(fù)dact2的表達(dá)，表明在肝細(xì)胞癌中Dact2的表達(dá)受表現(xiàn)遺傳學(xué)調(diào)控；恢復(fù)表達(dá)D