雞主要垂直傳播細菌病的三重熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌均是雞主要垂直傳播細菌病的病原。為了更好的對三種疾病致病原進行鑒別診斷，本研究對三種病原菌進行分離培養(yǎng)和鑒定，單一熒光定量PCR檢測方法以及多重熒光定量PCR檢測方法的研究，并組裝了檢測試劑盒，旨在為沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌的鑒別診斷提供一種簡單、用時少、敏感、特異的檢測試劑盒。
　　1.經培養(yǎng)分離獲得沙門氏菌流行菌株。分離菌株16S rRNA部分堿基序列之間同源性為99.7％，與GenBa

2、nk中AB594754、AB594759、AB594763、EU118085等腸道沙門氏菌處于同一個分支，同源性最高達99.8％。根據(jù)沙門氏菌invA基因設計引物，所建立的熒光定量PCR檢測方法，對沙門氏菌的檢測最低濃度可達101cfu/mL，敏感性比常規(guī)PCR方法高100倍，重復性試驗的變異系數(shù)為3.74％和0.10％。
　　2.經培養(yǎng)分離獲得大腸桿菌流行菌株。分離菌株16S rRNA部分堿基序列彼此之間序列同源性在99.3％～

3、100％之間，與GenBank中AY098487（雞源丹麥分離株）、NZ_CP015855（人源韓國分離株）、NZ_CP015995（雞源中國分離株）的同源性均較高。根據(jù)大腸桿菌FimH基因設計引物，所建立的熒光定量PCR檢測方法，對大腸桿菌的檢測最低濃度101cfu/mL，敏感性比常規(guī)PCR方法高100倍，重復性試驗的變異系數(shù)為0.91％和1.59％。
　　3.經培養(yǎng)分離獲得奇異變形桿菌流行菌株。分離16S rRNA部分堿基序列

4、彼此之間序列同源性為99.7％～100％，與AB272366（禽源雞源日本分離株）處于同一個分支，同源性最高達100％。根據(jù)奇異變形桿菌ureR基因設計引物，所建立的熒光定量PCR方法，對奇異變形桿菌的檢測最低限度可達101cfu/mL，敏感性比常規(guī)PCR方法高100倍，重復性試驗的變異系數(shù)為2.23％和1.68％。
　　4.建立了檢測沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌的三重熒光定量PCR方法，該方法對沙門氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿