線粒體K-,ATP-通道對心肌損傷大鼠線粒體膜電位影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分新生大鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng) 目的：應(yīng)用酶消化法進(jìn)行體外新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 方法：1-3日齡新生wistar大鼠,用0.08％胰蛋白酶和0.06％二型膠原酶重復(fù)消化心肌組織多次,收集的細(xì)胞用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混懸并過濾,采用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞后臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)存活心肌細(xì)胞百分比,檢測心肌細(xì)胞活性。之后將混懸于培養(yǎng)基中的心肌細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱孵育,連續(xù)觀察并記錄心肌細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化,

2、每2-3天換液一次。心肌細(xì)胞培養(yǎng)72h,進(jìn)行橫紋肌肌動蛋白(α-sacomericactin)免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng),檢測α-sacomericactin陽性表達(dá)率,檢測心肌細(xì)胞的特異性。 結(jié)果： 1.采用0.08％胰蛋白酶和0.06％膠原酶聯(lián)合消化心室肌組織,心肌細(xì)胞的收獲率高,細(xì)胞分散效果好,無明顯的組織碎塊和細(xì)胞碎片。 2.差速貼壁后,臺盼藍(lán)染色檢測心肌細(xì)胞活性,存活率為95.6％,95％可信區(qū)間(CI)為(89

3、.9％,99.1％)。 3.培養(yǎng)的心肌細(xì)胞2～3h后開始貼壁生長,12～24h明顯增殖,3～4d后細(xì)胞匯合成片。在倒置顯微鏡下心肌細(xì)胞呈圓形,梭形,多角形,伸出偽足,出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性搏動。 4.心肌細(xì)胞α-sacomericactin陽性表達(dá)率即心肌細(xì)胞的純度為94％,95％的可信區(qū)間(CI)為(90.4,97.6)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用酶消化法可簡便,快速地獲得大量活力高,特意性強(qiáng)的心肌細(xì)胞。 2

4、.體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞可以為心臟生理、病理及藥理的實(shí)驗(yàn)研究提供新模型。 目的：研究線粒體KATP通道開放保護(hù)異丙腎上腺素致體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞損傷的線粒體機(jī)制。 方法：應(yīng)用10μM異丙腎上腺素連續(xù)48小時作用于體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞建立模型。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：第一部分觀察線粒體KATP通道開放對線粒體膜電位的影響；第二部分觀察線粒體KATP通道開放對線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響。培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(CON組)、異丙

5、腎上腺素造模組(ISO組)、尼可地爾組(NIC組)、尼可地爾處理組(NIC+ISO組)(在造模前20min加入1mM nicorandil)、5-HD處理組(5-HD+NIC+ISO組)(在加入nicorandil前10min加入500μM 5-HD)、環(huán)孢菌素A組(CsA組)、環(huán)孢菌素A處理組(CsA+ISO組)(在造模前20min加入5mM CsA)。第一部分應(yīng)用流式細(xì)胞儀記錄各組線粒體膜電位的變化；第二部分進(jìn)行線粒體分離提純,應(yīng)用

6、紫外分光光度儀檢測線粒體體積,并用Cacl2處理15min觀察線粒體體積的變化趨勢及程度。 結(jié)果： 1.ISO組(模型組)紅色熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例為37.19±2.31％,△、ψm水平較CON組明顯降低,與CON組84.76±1.73％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=60.39,P<0.01),在ISO作用下△ψm消散:NIC+ISO組在ISO組基礎(chǔ)上提前20min加入nicrandil(特異性mitoKATP開放劑)進(jìn)

7、行藥物干預(yù),檢測紅色熒光細(xì)胞所占比例為70.99±1.68％,△ψm水平較ISO組明顯回升,與ISO組37.19±2.31％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=42.91,P<0.01),尼可地爾恢復(fù)△ψm極化狀態(tài)：5-HD+NIC+ISO組在NIC+ISO組基礎(chǔ)上提前10min加入5-HD(特異性mitoKATP通道阻滯劑)進(jìn)行干預(yù),檢測紅色熒光細(xì)胞所占比例為46.07±2.18％,△ψm水平較NIC+ISO組又明顯下降,與NIC+ISO組70

8、.99±1.68％相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=31.64,P<0.01),△ψm消散,5-HD拮抗了尼可地爾的保護(hù)作用。 2.ISO組(模型組)紅色熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例為37.19±2.31％,△ψm水平較CON組明顯降低,與CON組84.76±1.73％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=60.39,P<0.01),ISO致△ψm明顯消散；CsA+ISO組在ISO組的基礎(chǔ)上提前20min加入CsA(特異性mPTP阻滯劑),紅色熒光細(xì)

9、胞數(shù)所占比例為69.77±1.88％,△ψm水平較ISO組明顯回升,與ISO組37.19±2.31相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=39.53,P<0.01),△ψm恢復(fù)極化狀態(tài)。 3.ISO組線粒體吸光度(A1-A2)為0.0702±0.0103,下降不明顯,誘發(fā)mPTP開放,線粒體體積沒有出現(xiàn)明顯增大較初始狀態(tài)變化不大,與CON組0.2995±0.0142相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=55.92,P<0.01);CsA+ISO組在ISO

10、組基礎(chǔ)上提前20min加入CsA(特異性mPTP阻滯劑),線粒體吸光度(A1-A2)為0.2315±0.0101,較ISO組下降明顯,線粒體體積較初始狀態(tài)增大,與ISO組0.0702±0.0103相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=39.34,P<0.01),ISO使mPTP開放；NIC+ISO在ISO組基礎(chǔ)上提前20min加入nicorandil(特異性mitoKATP開放劑)進(jìn)行藥物干預(yù),線粒體吸光度(A1-A2)為0.2187±0.0089

11、,較ISO組下降明顯,線粒體體積較初始狀態(tài)增大,與ISO組0.0702±0.0103相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=36.22.P<0.05),預(yù)處理尼可地爾可以阻止mPTP開放；5-HD+NIC+ISO組在NIC+ISO基礎(chǔ)上提前10min加入5-HD(特異性mitoKAaV阻滯劑)進(jìn)行干預(yù),線粒體吸光度(A1-A2)為0.1012±0.0126,較NIC+ISO組下降不明顯,線粒體體積較初始狀態(tài)變化不大,與NIC+ISO組0.2187±0

12、.0089相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=28.66,P<0.05),5-HD取消了尼可地爾的保護(hù)效應(yīng),mPTP開放； 結(jié)論： 1.ISO可以使心肌細(xì)胞線粒體膜電位耗散/降低。 2.ISO可以使心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放。 3.抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放可以防止ISO引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位耗散/降低。 4.線粒體ATP敏感性鉀通道開放劑尼可地爾可以拮抗ISO引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位耗散/降低。