頭部淺低溫對(duì)全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:阻斷大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成全腦缺血，開(kāi)放血管后造成再灌注損傷，經(jīng)鼻咽腔實(shí)施冷鹽水灌注來(lái)降低大腦深部溫度，實(shí)現(xiàn)頭部的淺低溫，通過(guò)檢測(cè)缺血再灌損傷后大鼠海馬細(xì)胞線粒體膜電位的變化，以及觀察海馬CA1區(qū)Bcl-2，Bax蛋白，細(xì)胞色素C(Cytochrome C，CytC)蛋白和Pro-Caspase-3蛋白的表達(dá)，來(lái)探究線粒體膜電位變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及頭部淺低溫減少缺血再灌注損傷的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　

2、　1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　36只清結(jié)級(jí)成年Wistart大鼠，均為雄性，體重250～280g。隨機(jī)分成3組，每組12只，標(biāo)記為假手術(shù)組即S組，缺血再灌注組即I/R組，頭部淺低溫缺血再灌注組即HI/R組。
　　2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒁约邦^部淺低溫的實(shí)施
　　基于大鼠全腦四血管供血的解剖學(xué)基礎(chǔ)[1，3]，永久性閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈后，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成全腦缺血，開(kāi)放動(dòng)脈夾復(fù)灌制造缺血再灌注損傷模型，經(jīng)鼻咽降溫實(shí)現(xiàn)頭部淺低溫。大鼠禁食大于

3、8小時(shí)，記錄體重，腹腔注射水合氯醛麻醉，待其對(duì)針尖刺激無(wú)反應(yīng)后俯臥固定，在顱骨下觸及第一頸椎，沿中線切開(kāi)分離組織直至脊椎骨，暴露椎旁兩側(cè)翼小孔，用電燒尖燒閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，檢驗(yàn)無(wú)出血后逐層縫合。觀察24h再次麻醉大鼠，仰臥固定，插入氣管導(dǎo)管，持續(xù)吸入七氟醚，經(jīng)鼠頸分離雙側(cè)粗大頸總動(dòng)脈，準(zhǔn)備動(dòng)脈夾。S組大鼠僅分離出雙側(cè)翼小孔和頸總動(dòng)脈，不予其它處理。I/R組，HI/R組均燒灼翼小孔閉塞椎動(dòng)脈，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15min，開(kāi)放灌注24小時(shí)。其中

4、HI/R組在氣管插管后于鼻腔置入管路，灌注4℃晶體液降低腦溫，待海馬區(qū)溫度達(dá)33℃時(shí)進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉，開(kāi)放動(dòng)脈復(fù)灌1小時(shí)后停止降溫，自然復(fù)溫。
　　3實(shí)驗(yàn)樣本提取及檢測(cè)方法
　　3.1 JC-1熒光法顯微鏡下觀察大鼠海馬細(xì)胞線粒體膜電位變化
　　每組取大鼠4只，腹腔注射10％水合氯醛麻醉后迅速斷頭，取出大腦放于冰盤上分離海馬組織，標(biāo)本參照線粒體提取試劑盒使用方法提取線粒體，操作過(guò)程于低溫環(huán)境下進(jìn)行，標(biāo)本用于線粒體膜

5、電位的觀察。
　　3.2 Western Blot法測(cè)定Caspase-3酶原
　　每組取再灌注24小時(shí)大鼠4只，10％水合氯醛進(jìn)行麻醉，于鼠頸根部斷頭，低溫下分取鼠腦海馬組織，置于冷凍管密封，在液氮罐中快速超低溫冰凍標(biāo)本，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱長(zhǎng)時(shí)間保存。標(biāo)本用Western Blot方法測(cè)定Caspase-3酶原表達(dá)。
　　3.3免疫組化法觀察海馬CA1區(qū)CytC蛋白，Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)
　　每組取大鼠

6、4只麻醉，剪開(kāi)胸廓于心尖處插入細(xì)針，以0.9％氯化鈉灌注清洗血管，再以4％多聚甲醛溶液灌流固定，待大鼠全身僵直后即刻斷頭取腦分離海馬組織，標(biāo)本放入4％多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，4℃保存，用免疫組化法觀察Cyt C蛋白，Bcl-2蛋白及Bax蛋白。
　　結(jié)果:
　　1大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3酶原表達(dá)
　　相比于S組，I/R組Caspase-3酶原蛋白量減少，HI/R組Caspase-3酶原蛋白量減少，差異顯著，有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Caspase-3酶原蛋白量增加，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2大鼠海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白表達(dá)
　　相比于S組，I/R組，HI/R組Cyt C蛋白表達(dá)均明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Cyt C蛋白表達(dá)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)
　　相比于S

8、組，I/R組，HI/R組Bcl-2蛋白，Bax蛋白表達(dá)均明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，Bax蛋白表達(dá)明顯減少，兩者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞線粒體膜電位的觀察
　　S組在JC-1熒光濾片上觀察為高紅高綠（綠++紅++），染料聚集明顯，是膜電位正常時(shí)的熒光圖像;與S組比較，I/R組明顯表現(xiàn)為低紅高綠（綠++紅），紅色熒光下僅有極少