尼莫地平對大鼠全腦缺血-再灌注損傷后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:缺血-再灌注損傷是臨床常見的一種病理生理現(xiàn)象，涉及許多疾病的發(fā)生機(jī)制并影響其預(yù)后。良好的血液循環(huán)是組織細(xì)胞獲得充足的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并排出代謝產(chǎn)物的基本保證，各種原因造成的組織血流量減少均可使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，盡早恢復(fù)組織的血流灌注是減輕缺血性損傷的根本措施。但是，在動物實驗和臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)血液再灌注后，部分細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，因而將這種血液再灌注后缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷。尼莫地平系

2、二氫吡啶類衍生物，屬L-型Ca2+通道阻滯劑，它具有親脂性，可通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高度特異性與二氫吡啶類受體結(jié)合，調(diào)節(jié)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運。它能特異性阻斷電壓依賴鈣通道，減少Ca2+內(nèi)流，防止細(xì)胞內(nèi)的鈣超載。本研究應(yīng)用最新的流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測大鼠全腦缺血-再灌注后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax基因表達(dá)來觀察尼莫地平對大鼠全腦缺血-再灌注后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響，探討尼莫地平可能存在的作用機(jī)制。 方法： 1動

3、物與分組：選取健康成年雄性Wistar大鼠54只，體重在230～250克。隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(A組，6只)、鹽水對照組(B組，24只)、藥物治療組(C組，24只)。B、C組又根據(jù)干預(yù)起始時間點0h(再灌注即刻)、6h、12h、24h不同各自分為1、2、3、4四組。每組6只大鼠。 2模型制備：采用四條血管阻斷方法(Pulsinelli-4VO法)制備大鼠全腦缺血-再灌注模型。具體步驟為：將大鼠用10％水合氯醛(350mg/kg

4、)腹腔注射麻醉，背位固定后，于頸后1、2頸椎處切一切口，剝離頸部肌肉暴露第一頸椎雙側(cè)翼小孔，插入微型雙極電凝鑷，電凝椎動脈，使之永久閉塞，縫合傷口，置籠喂養(yǎng)。24小時后同法麻醉動物，腹位固定，頸前正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，用微動脈夾同時阻斷雙側(cè)血流，檢查遠(yuǎn)端血流情況以確保完全阻斷血流，15分鐘后，移去動脈夾，觀察雙側(cè)頸總動脈血流恢復(fù)后，絲線縫合傷口。缺血過程中，檢查雙側(cè)瞳孔，如瞳孔散大，說明產(chǎn)生全腦缺血；如瞳孔無變化，則認(rèn)為未產(chǎn)生全腦

5、缺血，應(yīng)剔除。再灌注后，有瞳孔固定、癲癇、抽搐等并發(fā)癥的均予放棄。低溫對腦缺血損傷有保護(hù)作用，為避免溫度對實驗結(jié)果的影響，維持肛溫在37±0.5℃。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，不阻斷血管。鹽水對照組分別于再灌注后0h、6h、12h、24h時間點開始及以后的各時間點累積腹腔注射生理鹽水5ml/kg·次，藥物治療組分別于再灌注后0h、6h、12h、24h時間點開始及以后的各時間點累積腹腔注射尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司規(guī)格：10mg

6、/50ml)1mg/kg·次。各組于再灌注48h統(tǒng)一處死。 3標(biāo)本制作：于假手術(shù)及再灌注后48h麻醉動物(10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射)，迅速斷頭取腦，將大腦于矢狀面切成兩半，分離雙側(cè)海馬組織，置于70％酒精中4℃保存待檢。 4流式細(xì)胞儀檢測：采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀，將海馬組織制備成單細(xì)胞懸液，300目銅網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊，離心2min(500～800r

7、/min)。取1×105細(xì)胞(0.1ml)加入碘化丙啶1ml，在4℃避光下行DNA染色，加入鼠抗人單克隆抗體工作液、羊抗鼠FITC-LgG二抗工作液作免疫熒光標(biāo)記，上機(jī)檢測，檢測前以雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器的變異系數(shù)(CV)在2％以內(nèi)。激發(fā)光源為15mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，應(yīng)用Expo32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬合分析。 5 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)均以均數(shù)

8、±標(biāo)準(zhǔn)差(X+S)表示，采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件分析，組間比較利用方差分析，兩兩比較運用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1 凋亡百分率：A組細(xì)胞凋亡率為(2.16±0.14)；B1組細(xì)胞凋亡率為(13.45±2.38)，B2組細(xì)胞凋亡率為(15.07±0.56)，B3組細(xì)胞凋亡率為(13.99±1.73)，B4組細(xì)胞凋亡率為(13.61±1.52)；C1組細(xì)胞凋亡率為(3.02±0.26)，C2組

9、細(xì)胞凋亡率為(4.37±0.55)，C3組細(xì)胞凋亡率為(5.31±0.37)，C4組細(xì)胞凋亡率為(8.06±0.74)。經(jīng)方差分析檢驗，F(xiàn)值為120.18，P值小于0.01，表明各組之間差異顯著。組間比較：A/B1、B1/C1、B2/C2、B3/C3之間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01；B4/C4之間有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05：A/C1之間無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。對照組組內(nèi)比較：B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B

10、4、B3/B4之間均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。治療組組內(nèi)比較：C1/C2、C2/C3之間無明顯差異，P＞0.05；C1/C3、C1/C4、C2/C4、C3/C4之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。 2.Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)(均道值)A組表達(dá)微弱，在此忽略。B組及C組熒光指數(shù)(FI)均大于1.0，為陽性表達(dá)。 2.1 Bcl-2蛋白的表達(dá)(均道值)B1組Bcl-2蛋白表達(dá)的均道值為(196.03±103.18)

11、，B2組為(271.07±90.62)，B3組為(260.77±90.16)，B4組為(260.30±95.85)；C1組Bcl-2蛋白表達(dá)的均道值為(680.25±57.47)，C2組為(630.36±59.02)，C3組為(513.64±34.98)，C4組為(446.44±34.56)。經(jīng)方差分析檢驗，F(xiàn)值為13.80，P值遠(yuǎn)小于0.01，表明各組之間差異顯著。組間比較結(jié)果如下：B1/C1之間有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01；B2/C2

12、、B3/C3、B4/C4之間有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。組內(nèi)比較結(jié)果如下：B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之間均無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；C1/C2、C1/C3、C2/C3、C3/C4之間無明顯差異，P＞0.05，C1/C4、C2/C4之間有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。 2.2 Bax蛋白的表達(dá)(均道值)B1組Bax蛋白表達(dá)的均道值為(765.49±90.59)，B2組為(753.56±61

13、.41)，B3組為(752.62±39.37)，B4組為(742.70±89.53)；C1組Bax蛋白表達(dá)的均道值為(365.53±42.95)，C2組為(463.62±40.95)，C3組為(529.20±49.17)，C4組為(587.69±29.84)。經(jīng)方差分析檢驗，F(xiàn)=41.12，P值遠(yuǎn)小于0.01，各組之間差異顯著。組間比較結(jié)果如下：B1/C1之間有明顯差異，P＜0.01；B2/C2、B3/C3、B4/C4之間有統(tǒng)計學(xué)差異，

14、P＜0.05。組內(nèi)比較結(jié)果如下：B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之間均無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05；C2/C3、C3/C4之間無明顯差異，P＞0.05，C1/C2、C1/C3、C1/C4、C2/C4之間均有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。 3.Bcl-2/Bax值B1組Bcl-2/Bax值為(0.26±0.14)，B2組為(0.36±0.13)，B3組為(0.35±0.13)，B4組為(0.36±0

15、.16)；Cl組Bcl-2/Bax值為(1.88±0.27)，C2組為(1.37±0.13)，C3組為(0.98±0.11)，C4組為(0.76±0.06)。經(jīng)方差分析檢驗，F(xiàn)=89.94，雅遠(yuǎn)小于0.01，各組之間差異顯著。組間比較結(jié)果如下：B1/C1、B2/C2之間有明顯差異，P＜0.01；B3/C3、B4/C4之間有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。組內(nèi)比較結(jié)果如下：B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之