局部淺低溫對(duì)大鼠全腦缺血再灌注后PTEN表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用鼻咽腔降溫法對(duì)大鼠實(shí)施頭部降溫，采用Pulsinelli四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注模型，觀察局部淺低溫對(duì)大鼠全腦缺血再灌注后PTEN表達(dá)的影響，并結(jié)合大鼠腦組織中MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)、S100B蛋白的含量以及海馬CA1區(qū)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，探討淺低溫對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備
　　1.1實(shí)驗(yàn)分組
　

2、　選用健康成年雄性Wistar大鼠66只，體重230-280g(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分成3組：即假手術(shù)組(Sham組)，常溫腦缺血再灌注組(I/R組)，淺低溫腦缺血再灌注組(HI/R組)。其中，I/R組和HI/R組根據(jù)再灌注時(shí)間的不同(再灌注時(shí)間分別為4h、8h、12h、24h、72h)又各自分成5個(gè)亞組。共11組大鼠，每組6只。
　　1.2動(dòng)物模型的制備及實(shí)驗(yàn)步驟
　　用10％水合氯醛350mg/kg向大

3、鼠腹腔注射麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，于頸后正中切開(kāi)皮膚，逐層分離肌肉暴露左右兩側(cè)翼突孔，用60瓦電烙鐵分別燒灼兩側(cè)椎動(dòng)脈使其永久閉塞，縫合切口。假手術(shù)組的大鼠只暴露翼突孔但不閉塞椎動(dòng)脈。24小時(shí)后再次麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，給大鼠氣管插管，吸氧，保留自主呼吸。于大鼠雙側(cè)頂部及顳部插入針狀電極，用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腦電波。大鼠四肢插入電極檢測(cè)心電圖。尾靜脈穿刺置管持續(xù)泵入乳酸林格氏液體，速度為1ml/h。常溫腦缺血再灌

4、注組的大鼠操作至此步驟便可夾閉頸總動(dòng)脈。淺低溫組大鼠則在其鼻腔插入深度為1cm的細(xì)硅膠管并固定，然后將大鼠放在立體定位儀上固定好，切開(kāi)頭皮暴露骨膜，定好海馬區(qū)體表標(biāo)志后，用微型顱鉆鉆破顱骨，將溫度探頭置于其下2mm以測(cè)腦溫。用靜脈泵向大鼠鼻咽腔輸注4℃冷生理鹽水使其腦溫降至33±0.5℃，并維持此溫度1h。當(dāng)大鼠腦溫降至33℃后開(kāi)始夾閉頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組大鼠只暴露頸總動(dòng)脈但不夾閉。常溫組和低溫組大鼠夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈時(shí)在其頸前正中部作一縱

5、行切口，然后逐層分離暴露頸總動(dòng)脈，用手術(shù)絲線穿過(guò)頸總動(dòng)脈并用動(dòng)脈夾分別夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉時(shí)間為15min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)大鼠麻醉深度間斷給予水合氯醛維持麻醉。
　　2.標(biāo)本采集及檢測(cè)方法
　　2.1標(biāo)本采集
　　根據(jù)大鼠腦缺血后再灌注時(shí)間的不同，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)將大鼠麻醉斷頭，打開(kāi)顱腔并取出腦組織。大鼠的左半腦放入4％多聚甲醛液中固定。把大鼠的右半腦先裝進(jìn)標(biāo)本袋后一并放入液氮罐1分鐘，后快速放入-70℃冰箱中保存。大

6、鼠的左半腦用于免疫組化檢測(cè)P-PTEN、Bcl-2、Bax，大鼠的右半腦用于制作組織勻漿檢測(cè)MDA、SOD、S100B。
　　2.2檢測(cè)方法
　　2.2.1 MDA、SOD、S100B蛋白的檢測(cè)
　　將取出的右半腦組織與0.9％生理鹽水制成10％和1％組織均漿。將配好的組織勻漿用離心機(jī)以4000轉(zhuǎn)/分鐘低溫離心10分鐘，取上清液。其中，1％的組織勻漿提取的上清液用來(lái)檢測(cè)SOD活力，SOD活力的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法。1

7、0％組織勻漿提取的上清液用來(lái)檢測(cè)MDA和S100B蛋白含量。MDA的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法即TBA法。S100B蛋白檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。上述各指標(biāo)的檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒要求進(jìn)行。Bcl-2、Bax、P-PTEN的檢測(cè)
　　將固定好的左半腦組織取出，用手術(shù)刀片在中線旁開(kāi)左半腦5mm處矢狀切腦組織，外側(cè)組織棄之。將修整好的組織常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，切片、脫蠟、入水、抗原修復(fù)、封閉等措施。Bc

8、l-2、Bax、P-PTEN的檢測(cè)均采用SP法，具體操作步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒要求進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　1.各組海馬CA1區(qū)P-PTEN蛋白表達(dá)的比較
　　與Sham組比較，I/R組在再灌注4h、8h、12h、24h、72h后P-PTEN均降低，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組比較，HI/R組P-PTEN表達(dá)在再灌注8h、12h、24h、72h較高，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在I/

9、R組中，P-PTEN在再灌注8h開(kāi)始降低，再灌注12h明顯降低，再灌注24h下降達(dá)最低值，再灌注72h有所升高但仍低于Sham組水平(P<0.05)。
　　2各組海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比較
　　與Sham組比較，I/R組的Bcl-2下降、Bax升高，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。與I/R組比較，HI/R組的Bcl-2在再灌注12h、24h升高，Bax在再灌注8h、12h、24、72h降低，兩組

10、間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。在I/R組中，Bcl-2在再灌注8小時(shí)開(kāi)始降低，在再灌注24小時(shí)下降達(dá)最低值，之后逐漸升高。Bax隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)直至再灌注72小時(shí)有所下降。
　　3各組腦組織中MDA含量和SOD活性的的比較
　　與Sham組比較，I/R組MDA含量增加、SOD活力下降，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。與I/R組比較，HI/R組在相同再灌注時(shí)間的MDA含量下降、SOD活力

11、增加，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。在I/R組中，MDA含量隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在再灌注24小時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降但仍高于Sham組含量。I/R組的SOD活力隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，至再灌注24小時(shí)活力降低達(dá)高峰，之后SOD活力逐漸增高。
　　4各組腦組織中S100B蛋白含量的比較
　　與Sham組比較，I/R組的S100B含量升高，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。與I/R組比較，