肺腫瘤抑制基因GPRC5A在肺癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：
　　利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型，研究GPRC5A作用的分子機(jī)理及關(guān)鍵性靶向信號(hào)通路，揭示GPRC5A抑制肺癌發(fā)生的作用及生物學(xué)意義。
　　材料與方法：
　　1.利用mRNA表達(dá)譜芯片分析比較野生型與Gprc5a基因敲除型小鼠氣管上皮細(xì)胞(MTEC)的差異表達(dá)，用RT-PCR和Westernblot的方法分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證。
　　2.構(gòu)建一系列GPRC5A截短體與缺失突變體，運(yùn)用l

2、uciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變體質(zhì)粒的功能活性，確定GPRC5A發(fā)揮抑制作用的功能結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)探究GPRC5A抑制EGFR信號(hào)通路的作用機(jī)制。
　　3.利用EGFR及其他信號(hào)通路的特異性抑制劑，分別處理Gprc5a-/-小鼠肺氣管上皮細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)不同藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　4.利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型，通過(guò)RT-PCR、Wes

3、ternblot，檢測(cè)Gprc5a-/-小鼠的肺組織中EGFR和STAT3信號(hào)通路是否有過(guò)度激活的情況。
　　5.在人的肺癌細(xì)胞系中，構(gòu)建GPRC5A的穩(wěn)定表達(dá)株，驗(yàn)證GPRC5A在人肺癌細(xì)胞中是否也有抑制EGFR信號(hào)通路的作用；裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)，研究GPRC5A對(duì)A549細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果表明，Gprc5a基因敲除小鼠MTEC細(xì)胞同野生型細(xì)胞相比

4、，其EGFR信號(hào)通路發(fā)生顯著增高。
　　2.Gprc5a基因敲除小鼠MTEC細(xì)胞中p-EGFR和p-STAT3異常性高表達(dá)；HEK293T細(xì)胞中，GPRC5A的高表達(dá)能夠抑制EGF誘導(dǎo)的EGFR-STAT3信號(hào)通路的過(guò)度激活。
　　3.GPRC5A的跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)橐种艵GFR信號(hào)通路所必須；GPRC5A可與EGFR發(fā)生物理相互作用，該功能由其跨膜結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)，二者在細(xì)胞膜上有共定位。
　　4.Gprc5a-/-MTEC細(xì)

5、胞對(duì)EGFR的3種抑制劑的敏感性都明顯高于Gprc5a+/+MTEC，其他信號(hào)通路的抑制劑對(duì)這兩種細(xì)胞增殖的抑制作用都相差不大。
　　5.Gprc5a-/-小鼠的肺組織中p-EGFR和p-STAT3的表達(dá)明顯高于Gprc5a+/+小鼠。
　　6.在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975和A549中過(guò)表達(dá)GPRC5A能抑制EGF誘導(dǎo)的或持續(xù)性激活的p-EGFR和p-STAT3；過(guò)表達(dá)GPRC5A能夠抑制A549細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能

6、力。
　　結(jié)論：
　　1.Gprc5a-/-MTEC中，EGFR-STAT3信號(hào)通路發(fā)生失控性增強(qiáng)，GPRC5A能夠抑制EGFR-STAT3信號(hào)通路的過(guò)度激活。
　　2.GPRC5A通過(guò)其跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)GFR發(fā)揮抑制作用；GPRC5A能夠與EGFR發(fā)生直接或者間接的相互作用，該功能由其跨膜區(qū)域所介導(dǎo)。
　　3.Gprc5a-/-小鼠MTEC細(xì)胞比野生型細(xì)胞更加依賴于EGFR信號(hào)通路。
　　4. Gprc5a